高壓氧對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠疼痛行為學(xué)及脊髓背角NOS表達(dá)的影響

田剛　涂青梅　鄭敏　羅興均　代夢(mèng)含　冉然　羅俊杰

?

·論著·

高壓氧對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠疼痛行為學(xué)及脊髓背角NOS表達(dá)的影響

田剛涂青梅鄭敏羅興均代夢(mèng)含冉然羅俊杰

目的觀察高壓氧對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠疼痛行為學(xué)及脊髓背角NOS表達(dá)的影響。方法成年雄性SD大鼠32只，隨機(jī)分成4組，每組8只，包括：假手術(shù)組(S組)、坐骨神經(jīng)結(jié)扎組(CCI組)、HBO預(yù)處理組(pre-HBO組)和HBO后處理組(post-HBO組)。所有大鼠CCI術(shù)前1 d測量機(jī)械痛閾值基線(MWT)。CCI術(shù)后第1、2、3、7、14、21和第28天觀察疼痛反應(yīng)行為，測量MWT。CCI術(shù)后第28天，對(duì)脊髓背角中nNOS、 eNOS及 iNOS陽性神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果CCI術(shù)前4組MWT值無明顯差異(P>0.05)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與S組比較，pre-HBO、post-HBO和CCI組MWT值明顯降低(P<0.05)，且CCI組下降幅度最大。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與CCI組比較，pre-HBO組和post-HBO組MWT值明顯高于CCI組(P< 0.05)。與S組比較，CCI后第28天CCI組、pre-HBO組和post-HBO組大鼠脊髓nNOS和 iNOS 陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(P< 0.05)。CCI組大鼠脊髓nNOS和 iNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯高于pre-HBO組和post-HBO組(P< 0.05)。4組大鼠脊髓eNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量未見明顯差異(P>0.05)。結(jié)論高壓氧對(duì)神經(jīng)痛的發(fā)生有預(yù)防和治療作用，可能通過降低NOS的表達(dá)緩解疼痛。

高壓氧；神經(jīng)病理性痛；疼痛行為學(xué)；一氧化氮合酶

神經(jīng)病理性痛是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和疾病引起，其基礎(chǔ)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)痛覺過敏。周圍神經(jīng)損傷誘發(fā)各種免疫炎性因子的釋放，如白介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-6，激活各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子導(dǎo)致痛覺過敏[1,2]。由于該種疾病的復(fù)雜性，當(dāng)前神經(jīng)病理性痛的治療并不令人滿意，超過 2/3 的患者不能獲得有效的減輕疼痛的治療[3]。因此，尋找一種新的有效的治療方法是神經(jīng)病理性痛領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。高壓氧(hyperbaric oxygen,HBO)可以增強(qiáng)抗氧化活性，加快自由基的清除，提高血氧含量，改善微循環(huán)和修復(fù)受傷的神經(jīng)組織。近年來，HBO一直被用于治療纖維肌痛、復(fù)雜區(qū)域疼痛綜合征、痙攣性頭痛和放療后疼痛[4]。但其對(duì)神經(jīng)病理性痛的影響方面研究較少。對(duì)于外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性痛，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)在受傷神經(jīng)和相應(yīng)脊髓起著重要的疼痛調(diào)節(jié)作用。本項(xiàng)研究旨在觀察高壓氧對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠疼痛行為學(xué)及脊髓背角NOS表達(dá)的影響，并確定其對(duì)神經(jīng)病理性痛的治療效果和作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組成年雄性SD大鼠32只，體重280～350 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分成4組，每組8只，包括：假手術(shù)組(S組)，坐骨神經(jīng)暴露但不結(jié)扎，不進(jìn)行HBO治療；坐骨神經(jīng)結(jié)扎組(CCI組)，坐骨神經(jīng)結(jié)扎，但不進(jìn)行HBO治療；HBO預(yù)處理組(pre-HBO組)， CCI術(shù)前12 h行HBO治療；HBO后處理組(post-HBO組)，CCI術(shù)后12 h行HBO治療。

1.2實(shí)驗(yàn)過程所有大鼠CCI術(shù)前1 d測量機(jī)械痛閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)基線。pre-HBO組大鼠當(dāng)晚暴露于HBO中。次日上午，所有大鼠行CCI或假手術(shù)。手術(shù)當(dāng)晚post-HBO組暴露于HBO中。CCI術(shù)后第1、2、3、7、14、21、28天，post-HBO組行HBO治療，治療12 h后觀察大鼠疼痛反應(yīng)行為。

1.3CCI模型制備大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，參照 Bennett 等[5]方法建立 CCI 模型。右下肢后外側(cè)切口確認(rèn)坐骨神經(jīng)干，用4-0鉻腸線松散結(jié)扎右側(cè)坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)外膜產(chǎn)生輕微壓力，即在神經(jīng)分布區(qū)域產(chǎn)生短暫肌肉收縮，縫合皮膚。意識(shí)恢復(fù)后大鼠回到籠中。S組大鼠坐骨神經(jīng)暴露但不結(jié)扎。

1.4HBO治療CCI前12 h或后12 h，pre-HBO或post-HBO組大鼠分別被置于高壓氧倉。進(jìn)艙后先用純氧充分洗艙10 min，替換艙內(nèi)空氣，使艙內(nèi)氧濃度≥90%。HBO治療參數(shù)為 0.25 MPa，純氧通氣10 min后，治療時(shí)間為60 min。加壓和減壓時(shí)間為 10 min(以 0.0125 MPa/min的速率勻速增減艙內(nèi)壓力)，30 min 內(nèi)減至正常壓力。

1.5標(biāo)本制備CCI 后第28天，1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，從左心室插管至升主動(dòng)脈，灌注0.9%氯化鈉溶液，直到無紅灌流液流出。之后灌注含4%多聚甲醛，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH值7.4)。灌注結(jié)束取 L4～L6 段脊髓，4%多聚甲醛浸泡，4℃固定過夜。用4%多聚甲醛固定新鮮標(biāo)本4 h，切片厚度40 μm，嵌入石蠟脫水。PBS清洗切片3次，分別加入3%的H2O2和30%的封閉血清。10 min后，分別加入神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS)抗體，4℃切片孵化48 h。PBS清洗切片3次，二抗37℃孵育1.5 h(羊抗免IgG)。PBS清洗切片3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育1.5 h。PBS清洗切片，二氨基聯(lián)苯胺顯色，酒精脫水，二甲苯透明化，樹膠密封，顯微鏡下觀察。在陰性對(duì)照試驗(yàn)中，PBS取代主要抗體，無陽性神經(jīng)元呈現(xiàn)。

1.6觀察項(xiàng)目根據(jù)Dixon描述的方法，使用Von-Frey 纖維細(xì)絲測量MWT[6]。大鼠置于測試箱，適應(yīng)環(huán)境30 min，后爪趾面放置Von-Frey 纖維細(xì)絲6～8 s，觀察后爪退縮反應(yīng)。每段脊髓從5個(gè)切片中選擇1個(gè)切片，對(duì)nNOS、 eNOS及 iNOS陽性神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。每只大鼠取四張切片以確定陽性細(xì)胞的數(shù)量。

2　結(jié)果

2.1一般行為學(xué)CCI術(shù)后第3天，除S組，其余大鼠右下肢腳趾彼此靠攏，伴隨背屈、外翻及不負(fù)重等動(dòng)作。CCI組大鼠與測痛儀表面接觸的膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)跛行，右腳腳掌偶爾懸空。CCI術(shù)后第14天，肌肉明顯萎縮，大鼠出現(xiàn)舔爪或擺動(dòng)患肢動(dòng)作。

2.2各時(shí)間點(diǎn)4組大鼠MWT值變化CCI術(shù)前各組MWT無明顯差異。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與S組比較，pre-HBO、post-HBO和CCI組MWT值明顯降低(P<0.05)，且CCI組MWT值下降幅度最大。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與CCI組比較，pre-HBO組MWT值明顯高于CCI組(P<0.05)，表明HBO對(duì)神經(jīng)痛的發(fā)生有預(yù)防作用。CCI術(shù)后第1～21天，與CCI組比較，post-HBO組MWT值明顯高于CCI組(P<0.05)，表明HBO對(duì)神經(jīng)痛有治療作用?；谶@2個(gè)最新發(fā)現(xiàn)，表明HBO預(yù)處理比HBO后處理更有效。見表1。

2.34組大鼠脊髓背角nNOS、iNOS和eNOS陽性細(xì)胞數(shù)比較

2.3.1nNOS和iNOS變化：與S組比較，CCI后第28天CCI組、pre-HBO組和post-HBO組大鼠脊髓nNOS和 iNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(P< 0.05)；CCI組大鼠脊髓nNOS和iNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯高于pre-HBO組和post-HBO組(P< 0.05)。見圖1、2，表2。

2.3.2eNOS變化：CCI后第28天，4組大鼠脊髓eNOS

組別前1d第1天第2天第3天第7天第14天第21天第28天S組9.8±2.39.2±2.58.8±1.98.3±2.18.6±1.88.7±2.09.0±1.89.0±2.1CCI組9.9±2.54.0±2.3*3.6±1.9*2.4±1.6*2.5±1.6*2.8±1.7*4.1±1.7*4.3±2.2*pre-HBO組10.2±2.47.1±2.1*#7.0±1.5*#6.3±1.6*#7.4±1.8*#7.0±2.7*#6.5±1.7*#6.1±2.1*#post-HBO組9.8±2.16.1±2.1*#6.0±1.6*#5.5±1.5*#6.3±1.7*#5.9±2.2*#4.7±1.6*#4.8±2.3*#

注：與S組比較,*P<0.05;與CCI組比較,#P<0.05

圖1　4組大鼠脊髓背角免疫組化切片中nNOS陽性神經(jīng)元的表達(dá)

圖2　4組大鼠脊髓背角免疫組化切片中iNOS陽性神經(jīng)元的表達(dá)

陽性神經(jīng)元數(shù)量未見明顯增多，CCI組、pre-HBO組和post-HBO組組間比較，大鼠脊髓eNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量未見明顯差異(P>0.05)。見圖3，表2。

圖3　4組大鼠脊髓背角免疫組化切片中eNOS陽性神經(jīng)元的表達(dá)

組別nNOS陽性細(xì)胞數(shù)iNOS陽性細(xì)胞數(shù)eNOS陽性細(xì)胞數(shù)S組9.49±2.2111.25±3.7218.54±2.23CCI組48.54±3.20*42.54±4.32*22.43±2.78pre-HBO組28.84±3.35*#28.52±4.12*#21.68±3.05post-HBO組32.86±2.88*#30.74±3.85*#21.34±3.18

注：與 S組比較,*P<0.05;與CCI組比較,#P<0.05

3　討論

神經(jīng)病理性疼痛是由中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷或系統(tǒng)功能障礙引起的慢性疼痛疾病， 是臨床治療的一大難題，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量，表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛，痛覺過敏和觸誘發(fā)痛。神經(jīng)痛引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)變化，導(dǎo)致痛覺過敏[7-9]，目前其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，尚未找到有效的治療方法，但發(fā)病率逐步上升，處理起來異常棘手。周圍神經(jīng)性疼痛最常見也最嚴(yán)重，阿片類藥物治療往往效果不佳。因此，神經(jīng)痛仍然是疼痛治療領(lǐng)域一個(gè)重要課題。

通過文獻(xiàn)回顧和分析，不難發(fā)現(xiàn)：感覺神經(jīng)損傷可能是神經(jīng)病理性痛的根本病因。2011年，國際疼痛學(xué)會(huì)(IASP)對(duì)神經(jīng)病理性疼痛疾病進(jìn)行了重新定義：“神經(jīng)病理性痛是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和疾病而直接造成的疼痛”。因此在感覺神經(jīng)損傷后，若早期給予有效的保護(hù)或治療，促進(jìn)神經(jīng)損傷“更好”地修復(fù)，可抑制神經(jīng)損傷所致病理性痛的產(chǎn)生。即使對(duì)那些已經(jīng)產(chǎn)生神經(jīng)病理性痛的患者，運(yùn)用具有神經(jīng)保護(hù)的藥物或手段，進(jìn)一步治療損傷，亦可緩解神經(jīng)病理性痛。

HBO能增強(qiáng)抗氧化活性，減輕神經(jīng)組織水腫，加速自由基的清除，增加血液中的氧含量，產(chǎn)生三磷酸腺苷，促進(jìn)毛細(xì)血管再生和改善微循環(huán)[10]，因此具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用，可促進(jìn)受損神經(jīng)的恢復(fù)。其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能是HBO有效增加血漿氧分壓和提高組織氧含量；減輕神經(jīng)組織水腫，改善神經(jīng)組織缺氧，促進(jìn)有氧新陳代謝和毛細(xì)血管再生；抑制炎性反應(yīng)，防止白細(xì)胞聚集，減少TNF-α、IL-1和IL-6分泌[11]。

一氧化氮(nitric oxide,NO)是神經(jīng)元細(xì)胞中新發(fā)現(xiàn)的一類神經(jīng)遞質(zhì),它由NOS催化而形成。在神經(jīng)系統(tǒng)工作過程中，NOS是NO合成的關(guān)鍵作用酶。由外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性痛，NOS在受損神經(jīng)和相應(yīng)脊髓起著重要的疼痛調(diào)節(jié)作用。有研究表明，疼痛傳入神經(jīng)末梢釋放大量谷氨酸，谷氨酸激活NMDA受體和NOS，從而增加興奮性。NOS介導(dǎo)了NO的生成增加，反過來進(jìn)一步提高谷氨酸的釋放，并導(dǎo)致疼痛[12]。另有學(xué)者研究證實(shí)，通過調(diào)控NO水平，HBO對(duì)缺氧、缺血或一氧化碳中毒引起的腦損傷有預(yù)防和治療作用[13]。HBO還可以激活內(nèi)源性阿片肽，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)[11]。這些研究表明，高壓氧治療不僅可以改善氧供，糾正缺氧，還可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生治療效果。

nNOS和eNOS統(tǒng)稱為結(jié)構(gòu)型NOS，受鈣離子調(diào)節(jié)，存在于正常組織，而iNOS則不受鈣離子調(diào)節(jié)。在神經(jīng)病理性痛中，脊髓中iNOS水平升高，轉(zhuǎn)錄和翻譯后，在NO合成過程中起重要作用。因此，周圍神經(jīng)損傷后，iNOS在脊髓的表達(dá)增加可促進(jìn)痛覺過敏。已經(jīng)證實(shí)，神經(jīng)病理痛大鼠模型中eNOS水平高于iNOS且eNOS對(duì)神經(jīng)痛有調(diào)節(jié)作用[14,15]。nNOS受鈣離子調(diào)節(jié)，有許多亞型，分別位于不同的細(xì)胞發(fā)揮不同的作用。一般來說，由于神經(jīng)毒性作用，脊髓中的nNOS和iNOS可能是有害的，而在組織損傷后，周圍神經(jīng)中的eNOS經(jīng)常是有益的。本研究發(fā)現(xiàn)，高壓氧能有效降低脊髓背角nNOS和iNOS的表達(dá)水平，但未能改變eNOS的水平；因此，HBO可能通過調(diào)節(jié)脊髓背角nNOS和iNOS的表達(dá)減輕痛覺過敏。

CCI大鼠脊髓背角NOS陽性神經(jīng)元表達(dá)增加，提示脊髓背角NOS陽性神經(jīng)元在慢性神經(jīng)性疼痛的中樞機(jī)制中起著重要作用。HBO可能通過降低NOS的表達(dá)緩解疼痛。本項(xiàng)研究中，HBO治療只有一次，因此，HBO治療的最佳頻率尚有待探討。

1Sacerdote P, Franchi S, Trovato AE. Transient early expression of TNF-alpha in sciatic nerve and dorsal root ganglia in a mouse model of painful peripheral neuropathy. Neurosci Lett，2008,436:210-213.

2Perez-Severiano F, Bermudez-Ocana DY. Spinal nerve ligation reduces nitric oxide synthase activity and expression: Effect of resveratrol. Pharmacol Biochem Behav,2008,90:742-747.

3Finnerup EM,Sindrup SH,Jensen TS.The evidence for pharmacological treatment of neuropathic pain. Pain,2010,150:573-581.

4Wilson HD, Toepfer VE, Senapati AK, et al. Hyperbaric oxygen treatment is comparable to acetylsalicylic acid treatment in an animal model of arthritis. J Pain,2007,8:924-930.

5Bennett GJ, Xie YK. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain,1988,33:87-107.

6Dixon WJ. Efficient analysis of experimental observations. Ann Rev Pharmacol Toxicol,1980,20:441-462.

7Milligan ED, Watkins LR. Pathological and protective roles of glia in chronic pain. Nat Rev Neurosci,2009,10:23-36.

8Tan YH,Meng LX,Cui JJ.Changes and relationships of pain threshold and serum IL-6 in rats with sciatic nerve injury induced by chronic constriction.J China Med Univ,2005,34:431-432.

9Chen H,Meng LX,Cui JJ.Intrathecal injection of morphine and ketamine on the NMDAR1 mRNA expression in the spinal cord in a neuropathic pain rat model. Chinese J Anesthesiol,2008,28:644-647.

10Wilson HD, Wilson JR, Fuchs PN. Hyperbaric oxygen treatment decreases inflammation and mechanical hypersensitivity in an animal model of inflammatory pain. Brain Res,2006,1098:12612-12618.

11Zelinski LM, Ohgami Y, Chung E, et al. A prolonged nitric oxide-dependent, opioid-mediated antinociceptive effect of hyperbaric oxygen in mice. J Pain,2009，10:167-172.

12Przewlocki R, Machelska H, Przewlocka B. Inhibition of nitric oxide synthase enhances morphine antinociception in the rat spinal cord. Life Science,1993,53:PL1-5.

13Yu L,Fei L,Zhang HR.Effects of hyperbaric oxygen on free radical and ite scavenging system in the brain of mice with carbon monoxide poisoning. Chinese J Emerg Med,2004,13:441-443.

14Tanabe M, Nagatani Y, Saitoh K, et al. Pharmacological assessments of nitric oxide synthase isoforms and downstream diversity of NO signaling in the maintenance of thermal and mechanical hypersensitivity after peripheral nerve injury in mice. Neuropharmacology,2009,56:702-708.

15Han G,Li L,Meng L.Effects of hyperbaric oxygen on pain-related behaviours and nitric oxide synthase expression in a rat model of neuropathic pain.Pain Res manage,2013，18:137-141.

Effects of hyperbaric oxygen on pain-related behaviours and expression levels of nitric oxide synthase in rats with neuropathic pain

TIANGang*,TUQingmei,ZHENGMin*,etal.

*DepartmentofAnesthesia,People’sHospitalAffiliatedtoHubeiMedicineUniversity,Hubei,Wuhan442000,China

ObjectiveTo investigate the effects of hyperbaric oxygen (HBO) on pain-related behaviours and expression levels of nitric oxide synthase in rats with neuropathic pain.MethodsThirty-two male Sprague Dawley rats were randomly divided into four groups;sham operation group (group S),sciatic nerve ligation group (CCI group),HBO pretreatment group (pre-HBO group) and HBO post-treatment group (post-HBO group),with 8 rats in each group. The baseline mechanical withdrawal thresholds (MWT) were measured one day before CCI for all the rats.The pain-related behaviours were observed on 1d,2d,3d,7d,14d,21d,28d after CCI,and MWT was also measured.Moreover the numbers of nNOS, eNOS and iNOS positive neurons in cornu dorsale medullae spinalis were calculated on 28d after CCI.ResultsThere was no significant difference in MWT before CCI among the 4 groups (P>0.05).The MWT in pre-HBO group, post-HBO group and CCI group in every time point was significantly lower than that in group S (P<0.05),moreover,the decrease degree in CCI group was the most obvious (P<0.05). The MWT in pre-HBO group and post-HBO group in every time point was significantly higher than that in CCI group (P<0.05).As compared with those in group S,the numbers of nNOS and iNOS positive neurons in CCI group,pre-HBO group and post-HBO group on 28d after CCI were significantly increased (P<0.05).The numbers of nNOS and iNOS positive neurons in CCI group were significantly higher than those in pre-HBO group and post-HBO group (P<0.05).However there were no significant differences in numbers of eNOS positive neurons among 4 groups (P>0.05).ConclusionHBO has preventive and therapeutic effects on neuropathic pain,which can relieve pain,and its action mechanism may be correlated to the decrease of the expresion levels of NOS.

hyperbaric oxygen; neuropathic pain;pain ethology; nitric oxide synthase

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.18.012

442000湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院麻醉科(田剛、鄭敏、羅興均、代夢(mèng)含、冉然)，神經(jīng)外科(羅俊杰)；湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院藥學(xué)部(涂青梅)

羅俊杰，442000湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院麻醉科；

E-mail:luozunjie@163.com

R 441.1

A

1002-7386(2016)18-2765-04

2016-03-12)

項(xiàng)目來源：湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：B2014052)