苦參堿對硫代乙酰胺誘導的肝纖維化大鼠的影響

覃仁武邱紹勤?陳賽專

［1.宜昌市第三人民醫(yī)院，湖北 宜昌443003； 2.三峽大學中醫(yī)臨床醫(yī)學院（宜昌市中醫(yī)醫(yī)院），湖北宜昌443000］

肝纖維化是由病毒感染、藥物毒性、膽汁淤積、代謝疾病及免疫紊亂等各種病因導致的肝臟慢性損傷修復反應，其發(fā)病機制尚未完全清楚；但通常認為，肝損傷激活肝星狀細胞（HSC），引起細胞外基質（ECM）堆積是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)［1-3］。肝纖維化若不能得到抑制，將進一步發(fā)展為肝硬化及肝癌而危及生命；而目前研究認為，肝纖維化是可逆的，因此，積極有效控制肝纖維化尤為重要［4］。一直以來，傳統(tǒng)中藥在治療肝纖維化時發(fā)揮著一定作用，引起了研究者們挖掘和探索［5］。苦參堿是從中藥苦參中提取出的生物堿，現(xiàn)代研究認為其具有抗腫瘤、抗炎、抗纖維化等多種作用［6］。本課題以SD 大鼠為實驗對象，從血清水平，肝臟病理形態(tài)，α-SMA 表達，及肝臟CTGF、α-SMA和TIMP-1 mRNA 表達幾個方面，驗證苦參堿抗肝纖維化的作用。

1 材料

1.1 動物 雄性SD 大鼠50 只，體質量（200±20）g，購于三峽大學實驗動物中心，許可證號SYXK（鄂）2017-0061。標準飼料，自由攝食和飲水，適應性喂養(yǎng)1 周后開始實驗。

1.2 藥物與試劑 苦參堿購于成都德思特生物技術有限公司（CAS 62-55-5，純度≥98%），硫代乙酰胺購于德州潤昕實驗儀器有限公司（CAS 519-02-8，純度≥99%）。α-SMA抗體購于英國Abcam 公司（ab32575）；二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司（AB205718）；DAB 顯色試劑盒購自碧云天生物技術研究所（AR1025）；CTGF、α-SMA 和TIMP-1 核苷酸引物序列（表1）于GenBank 查找，由武漢擎科生物技術有限公司合成。

1.3 儀器 電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；UPT-3 A 發(fā)光免疫分析儀（德國西門子公司）；DMR 型多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（德國Leica 公司）；KX41 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；qRT-PCR 儀（美國Illumina 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 將大鼠隨機分為空白組、模型組、苦參堿低、中、高劑量組（40、80、160 mg／kg），每組10 只。除空白組外，其余各組均按200 mg／kg 劑量皮下注射0.03%硫代乙酰胺生理鹽水溶液，空白組皮下注射生理鹽水1 mL／kg，2 次／周，共注射10 周。從第5 周開始，給藥組每天灌胃相應給藥劑量苦參堿，空白組及模型組灌胃生理鹽水，灌胃給藥到第10 周。

表1 引物序列

2.2 血清生化指標檢測 10 周后麻醉大鼠，剖開大鼠腹部，下腔靜脈采集血液，離心分離出血清，保存于-20 ℃冰箱。用全自動生化分析儀檢測血清中肝功能指標ALT、AST 水平，及肝纖維化指標HA、CIV 和PCⅢ水平。

2.3 HE 染色 10 周后麻醉大鼠，取中葉于4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，將石蠟包埋的肝組織作HE 染色切片，置于光鏡下觀察肝組織形態(tài)，判斷是否有纖維化及纖維化程度。

2.4 免疫組化 10 周后麻醉大鼠，取中葉于4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，取出石蠟包埋的肝組織制備切片，脫蠟脫水，修復抗原，封閉，滴加α-SMA 一抗，4 ℃過夜，滴加二抗，DAB 顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復染，脫水，樹膠封片，置于光鏡下觀察。

2.5 qRT-PCR 取出保存于-80 ℃冰箱中的肝組織，按說明用Trizol 試劑于勻漿器中提取總RNA，并于各組取2 μL總RNA，按20 μL 總反應體積，反轉錄為cDNA。取cDNA模板1 μL，加5 μL Sybr 試劑，0.2 μL Rox 試劑，相應前后引物各0.2 μL，DEPC 3.4 μL，共10 μL，于qRT-PCR 儀器中；95 ℃預變性10 s，95 ℃變性15 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，45 個循環(huán)。反應結束后，得到各樣本CT 值，然后利用2-△△Ct計算各組基因的的相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學分析 采用Graph Pad Prism 6 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 血清肝功能、肝纖維化指標水平 與空白組比較，模型組ALT、AST、HA、CIV 和PCⅢ水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，苦參堿低、中、高劑量組ALT、AST、HA、PCⅢ水平降低（P＜0.05，P＜0.01），其中苦參堿高劑量組CIV 水平也降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清肝功能、肝纖維化指標水平（， n＝10）

表2 各組大鼠血清肝功能、肝纖維化指標水平（， n＝10）

注：與空白組比較，??P＜0.05，與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 肝臟組織HE 染色病理學 空白組肝細胞排列整齊，肝小葉結構完整，未見纖維組織增生。模型組肝小葉結構破壞，肝細胞排列紊亂，可見變性、壞死肝細胞及纖維增生，中央靜脈偏移或缺如。苦參堿各劑量組肝小葉結構破壞較輕，肝細胞排列較為整齊，纖維增生較少。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色結果（×100）

3.3 免疫組化檢測α-SMA 蛋白表達 與空白組比較，模型組大鼠肝臟組織中α-SMA 蛋白表達增加。與模型組比較，不同劑量苦參堿干預后，肝臟組織中α-SMA 蛋白表達不同程度的下降。見圖2。

3.4 qRT-PCR 檢測CTGF、α-SMA、TIMP-1mRNA 表達與空白組比較，模型組較CTGF、α-SMA、TIMP-1 mRNA 表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，苦參堿各劑量組CTGF、α-SMAmRNA 表達均降低（P＜0.01），其中苦參堿中、高劑量組TIMP-1 mRNA 也降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠肝組織CTGF、 α-SMA、 TIMP-1 mRNA 表達（n＝10）

4 討論

肝纖維化是各種病因導致的肝臟的慢性損傷修復反應、HSC 增殖活化、ECM 增多、以巨噬細胞為主的免疫細胞浸潤等，形成不平衡的纖維化瘢痕［7］。炎癥及損傷反應可進一步加重肝纖維化，從而導致肝硬化及肝癌［8-9］。近年來，多數(shù)學者認為，肝纖維化是可逆的，通過終止肝組織的慢性損傷和解除肝內慢性炎癥等，可重塑瘢痕組織，恢復肝功能，從而治愈肝纖維化甚至肝硬化［10］。目前研究表明，苦參堿具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗纖維化等作用；有文獻認為，苦參堿可抑制活化的HSC，保護肝細胞，改善肝功能，從而起到治療肝纖維化的作用［11］。

從本研究結果可以看出，苦參堿可降低肝纖維化大鼠的ALT、AST 水平，改善肝纖維化大鼠的肝功能，降低了肝纖維化的血清指標，并能減輕纖維組織增生，抑制肝小葉結構改變，表明其具有抗肝纖維化、改善肝功能的作用。

由肝細胞和HSC 產生的CTGF，可分別通過TGF-β1 依賴性信號和非TGF-β1 依賴性信號活化，激活肌纖維母細胞，促進ECM 的堆積和重構。Weiskirchen［10］認為，CTGF能反映出肝纖維化的嚴重程度，并且抑制CTGF 是阻止和逆轉肝纖維化的重點。MMP／TIMP 酶類可調節(jié)ECM 的沉積與降解，一方面MMPs 可促進ECM 的降解，TIMP-1 可抑制MMPs 的活性；另一方面TIMP-1 可阻止HSC 的凋亡，從而增加HSC 活化后分泌ECM 的數(shù)量。因此，通過降低TIMP-1 表達，可起到調節(jié)ECM 的作用，從而抑制肝纖維化［12］。α-SMA 是與肝纖維化過程呈正相關的重要細胞因子，它與TGF-β1 協(xié)同促進肝纖維化，降低α-SMA的表達，可起到抑制肝纖維化的作用［13-14］。在本研究中，苦參堿各劑量組均不同程度降低了α-SMA 蛋白表達以及CTGF、TIMP-1 和α-SMAmRNA 表達，表明苦參堿抑制肝纖維化的作用，可能與調控這些細胞因子及其相關信號通路有關。但與復雜的肝纖維化發(fā)生發(fā)展機制相比，對這幾個細胞因子的研究還有明顯的局限，對相關信號通路的研究也有待完善。