蜜環(huán)菌發(fā)酵液對睡眠剝奪小鼠行為學及氧化應激水平的影響

呂瑞娜萬茜淋田風華賈傳文李長田?

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春130118； 2.長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春130117）

蜜環(huán)菌Armillaria mellea（Vahl）P.Kumm.分類上隸屬于真菌界（Fungi）、擔子菌門（Basidiomycota）、蘑菇綱（Agaricomycetes）、蘑菇目（Agaricales）、泡頭菌科（Physalacriaceae）、蜜環(huán)菌屬（Armillaria）［1］，是一種藥食兼用菌，其與傳統(tǒng)中藥天麻存在著微妙的共生關系，大量研究表明，蜜環(huán)菌及其發(fā)酵產(chǎn)物與天麻存在著許多相似的藥理作用［2］?，F(xiàn)代研究表明，蜜環(huán)菌及其發(fā)酵產(chǎn)物具有很好的調節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功效，包括鎮(zhèn)靜安神、抗驚厥、抗老年癡呆、保護缺血性腦組織等［3-4］。隨著蜜環(huán)菌發(fā)酵工藝的成熟及其藥理活性的深入研究，相繼開發(fā)出了以蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物為主的多種腦保健制劑，包括蜜環(huán)菌糖漿、健腦露、蜜環(huán)菌浸片、腦心舒口服液等［4］，其中，以蜜環(huán)菌濃縮液及蜂王漿兩味藥材制成的腦心舒口服液主要用于身體虛弱、心神不安、失眠多夢、神經(jīng)衰弱、頭痛眩暈［5］。

睡眠是一種相對無意識的生理狀態(tài)。睡眠不足是由于缺乏足夠的恢復性睡眠而導致的。它是一種影響大腦和許多身體系統(tǒng)的應激源［6］。睡眠剝奪對機體的影響是整體的，多方面的，多層次的。從機體的行為學表現(xiàn)上，睡眠剝奪會使機體易疲憊，自主活動降低，學習記憶能力下降，情緒上易激惹。從機體的代謝層次上，睡眠剝奪會打破機體內的氧化和抗氧化平衡、神經(jīng)遞質平衡、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的協(xié)調，從整體上影響機體的健康。對人類和大多數(shù)動物而言，睡眠不足是非常危險的，它會加快疾病的進程，縮短壽命［7］。睡眠對身體系統(tǒng)的影響是非常復雜的，研究已經(jīng)證明睡眠剝奪對身體系統(tǒng)的不同影響取決于睡眠剝奪的長度和測量指標的時間框架［8-9］。

目前，對于睡眠剝奪的治療多采用安定、唑吡坦等西藥，服用后均有不同程度的不良反應，產(chǎn)生藥物依賴。蜜環(huán)菌發(fā)酵液是一種由藥食兼用蜜環(huán)菌發(fā)酵而來的非化學合成自然發(fā)酵基質，具有安全、易得的特點。已有大量研究表明，蜜環(huán)菌及其發(fā)酵液可延長戊巴比妥鈉等西藥誘導的小鼠睡眠時間［10］，因而，其被廣泛認為具有鎮(zhèn)靜安神的效力，然而，鮮有研究直接以睡眠剝奪為模型來探究蜜環(huán)菌發(fā)酵液對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。在本研究中，以更符合臨床癥狀的睡眠剝奪為模型，來探討蜜環(huán)菌發(fā)酵液對睡眠剝奪小鼠行為學及氧化應激水平的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF 級昆明小鼠，4 周齡，體質量18～22 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2015-0001。

1.2 儀器 自制小鼠水平臺睡眠剝奪箱，ZZ-6 小鼠自主活動測試儀（成都泰盟科技有限公司）；RE-52AA 旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；FD-2C 冷凍干燥機（國產(chǎn)）；352 型-酶標儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS）；TG16 W-微量高速離心機（國產(chǎn)）；GNP-9080 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（國產(chǎn)）。

1.3 試劑 小鼠超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（18090328）、丙二醛（MDA）試劑盒（18090345），均購于江蘇酶免實業(yè)有限公司；腦心舒口服液（170518），購于吉林敖東集團金海發(fā)藥業(yè)股份有限公司，凍干，備用。

1.4 蜜環(huán)菌發(fā)酵液制備 實驗用蜜環(huán)菌菌株來自吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，蜜環(huán)菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)12 d，過濾，60 ℃濃縮，采用腦心舒口服液的入藥標準對蜜環(huán)菌發(fā)酵液進行質量檢測，合格，凍干，備用。

2 方法

2.1 實驗環(huán)境控制 室內溫度（24±2）℃，相對濕度50%～60%，光照／黑暗周期為12 h／12 h。

2.2 小鼠睡眠剝奪模型的建立及分組給藥 本實驗采用多平臺水環(huán)境法進行睡眠剝奪，即在睡眠剝奪箱（長30 cm、寬20 cm、高15 cm）中設置直徑2 cm，高5 cm 的平臺，每箱6 個，睡眠剝奪箱中注水，水面低于平臺1 cm，水溫保持在24 ℃左右。在睡眠剝奪箱中放入小鼠，小鼠可在平臺之間活動站立，飲食飲水。在平臺上小鼠可進入非快速動眼睡眠（NREM），但當小鼠進入快速動眼睡眠（REM）時，由于全身骨骼肌張力的下降，頸部肌張力也隨之降低，使小鼠節(jié)律性低頭、進而觸水清醒，從而無法進入REM，就此達到睡眠剝奪的目的［11］。正常對照組小鼠使用直徑6 cm的平臺，小鼠可在平臺上正常進入睡眠。50 只昆明小鼠，雌雄各半，隨機分為5 組，每組10 只，分別為腦心舒口服液組，蜜環(huán)菌發(fā)酵液高、低劑量組，正常對照組，模型組。蜜環(huán)菌發(fā)酵液高、低劑量組分別按1 421.42 mg／kg、710.71 mg／kg 的劑量灌胃給藥［12］，腦心舒口服液組按人鼠換算劑量1 226 mg／kg 灌胃給藥，正常對照組和模型組給予蒸餾水。新到小鼠適應性飼養(yǎng)3 d，預灌胃5 d，第9 天開始每天對除正常對照組外的其它組小鼠采用多平臺水環(huán)境法進行睡眠剝奪20 h（14：00～次日10：00），共睡眠剝奪60 h，睡眠剝奪期間繼續(xù)給予試驗藥物。在睡眠剝奪20 h和40 h，灌胃給藥1 h 后，分別對小鼠進行自主活動測試和負重游泳測試，末次灌胃給藥1 h 后，眼球取血，頸椎脫臼處死，取腦。

2.3 小鼠行為學測試

2.3.1 自主活動測試 按照“2.2”項下分組給藥方式進行分組給藥，在睡眠剝奪20 h 灌胃給藥1 h 后，將小鼠放入小鼠自主活動測試儀中適應5 min，之后記錄小鼠在5 min內的活動次數(shù)和站立次數(shù)。在試驗過程中，保持周圍環(huán)境安靜，無人員走動，避免外界因素對小鼠的干擾。

2.3.2 小鼠負重游泳實驗 按照“2.2”項下分組給藥方式進行分組給藥，在睡眠剝奪40 h 灌胃給藥1 h 后，對小鼠進行負重游泳測試。在小鼠尾巴根部固定小鼠體質量10%重量的鉛塊，將小鼠放入溫度（24±2）℃，深度高于30 cm 的水箱中游泳，記錄小鼠從開始游泳至沉入水下5 s不能浮出水面的時間。

2.4 氧化應激水平的檢測 按照“2.2”項下分組給藥方式進行給藥，在末次灌胃給藥1 h 后，眼球取血，3 500 r／min離心10 min，吸取上清。眼球取血后，頸椎脫臼處死小鼠，立即置于冰上取腦，用冰過的生理鹽水將小鼠腦組織上的殘血清洗干凈，無菌濾紙吸干水分，稱重，按腦組織與冰生理鹽水1∶9 的比例進行勻漿，4 ℃，3 500 r／min離心10 min，取上清。采用小鼠超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒和丙二醛（MDA）試劑盒檢測小鼠血清及腦組織中SOD 的活性和MDA 的水平。試劑盒的使用嚴格按照試劑盒的說明書進行操作。

2.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 23 軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有實驗結果的數(shù)值都以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 行為學測試

3.1.1 小鼠自主活動 與正常對照組比較，模型組的活動次數(shù)和站立次數(shù)下降（P＜0.01），表示睡眠剝奪能明顯降低小鼠的自主活動。與模型組比較，蜜環(huán)菌發(fā)酵液高劑量組能提高小鼠的自主活動，活動次數(shù)、站立次數(shù)增加（P＜0.01）；蜜環(huán)菌發(fā)酵液低劑量組站立次數(shù)增加（P＜0.05）。見表1。

表1 小鼠的自主活動和站立次數(shù)（， n＝10）

表1 小鼠的自主活動和站立次數(shù)（， n＝10）

注：與正常對照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.1.2 小鼠負重游泳 與正常對照組比較，模型組小鼠的游泳時間下降（P＜0.01），表明睡眠剝奪能有效降低小鼠的抗疲勞能力。與模型組比較，蜜環(huán)菌發(fā)酵液高能延長小鼠的游泳時間（P＜0.01）。見表2。

表2 小鼠負重游泳時間（， n＝10）

注：與正常對照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.2 氧化應激水平

3.2.1 小鼠血清和腦組織中MDA 水平 與正常對照組比較，模型組血清及腦組織中的MDA 水平均提高（P＜0.05，P＜0.01），表明睡眠剝奪能明顯提高小鼠血清及腦組織中的MDA 水平。與模型組比較，蜜環(huán)菌發(fā)酵液高、低劑量組均能降低小鼠血清及腦組織中MDA 水平（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 小鼠血清和腦組織中丙二醛（MDA）水平（，n＝10）

注：與正常對照組比較，?P＜0.01，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2.2 小鼠血清和腦組織中SOD 活性 與正常對照組比較，模型組血清及腦組織中的SOD 活性均降低（P＜0.05），表明睡眠剝奪能明顯降低小鼠血清及腦組織中的SOD 活性。與模型組比較，蜜環(huán)菌發(fā)酵液高、低劑量組均能一定程度上提高小鼠血清及腦組織中SOD 水平，差異無統(tǒng)計學意義。見表4。

表4 小鼠血清和腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性（， n＝10）

表4 小鼠血清和腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性（， n＝10）

注：與正常對照組比較，?P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05。

4 討論

自主活動是在無外界干預的條件下，通過小鼠在一定空間內的自發(fā)活動次數(shù)和站立次數(shù)來反映小鼠的精神行為興奮性，劉長云等［13］人的研究結果表明，隨著睡眠剝奪時長的增長，大鼠的行為興奮性表現(xiàn)為先興奮后抑制，在本實驗的睡眠剝奪強度下呈現(xiàn)的結果與該結果一致。負重游泳是一種強迫小鼠游泳的行為學測試方法，通過游泳的時間來反映小鼠對疲勞的承受能力，是一種衡量小鼠整體機體組織和臟器狀態(tài)的評價方法，許光輝等［14］人的研究結果顯示，睡眠剝奪能顯著降低小鼠的抗疲勞能力，該結果與本研究結果一致。當給予睡眠剝奪小鼠一定劑量的蜜環(huán)菌發(fā)酵液后，在自主活動及負重游泳測試中，小鼠的相應指標均得到了提高，與正常對照組差異不顯著，說明蜜環(huán)菌發(fā)酵液能很好的緩解睡眠剝奪造成的小鼠行為學指標的異常。

活性氧（ROS）是線粒體呼吸和其它細胞代謝過程的自然副產(chǎn)品，對氧化還原信號和細胞功能至關重要。它們在正常條件下被細胞抗氧化機制安全地代謝。然而，如果ROS 的生成超過細胞的抗氧化能力，非生理的毒性ROS 就會在氧化應激的過程中被釋放。一般來說，氧化應激是細胞功能障礙和細胞死亡的標志，這是由于非生理性ROS 與蛋白、核酸、碳水化合物和脂質發(fā)生了非正常反應導致的［15］。SOD 是一種能清除體內超氧陰離子自由基的重要酶類［16］。MDA 是機體內氧自由基攻擊細胞膜上的多不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化后的主要產(chǎn)物，通常被認為是脂質過氧化的指標［17］。倪娜娜［18］研究結果顯示，睡眠剝奪會顯著降低小鼠藍斑神經(jīng)元的抗氧化水平，何亮［19］的研究結果顯示，睡眠剝奪會顯著降低小鼠血漿、心肌組織和腦組織的SOD 活性，增加其MDA 水平，本實驗的檢測結果與前人的結果一致。當睡眠剝奪小鼠被給予一定劑量的蜜環(huán)菌發(fā)酵液后，對其腦組織及血清中的MDA 水平和SOD活性進行檢測，結果顯示，小鼠腦組織及血清中的MDA 水平均顯著下降，而SOD 水平未有明顯提高。由該結果猜測，MDA 水平的下降，說明小鼠體內的ROS 水平較少，氧化程度較低，故SOD 活性也相應降低，抗氧化強度也較小。翟鳳艷［20］、杜剛與潘云峰等［21-22］人的研究結果顯示，蜜環(huán)菌乙醇提取物及蜜環(huán)菌油等均具有體外直接清除ROS的功效，從側面證明蜜環(huán)菌具有清除ROS 的作用，但要直接證明該猜測，還需檢測小鼠體內ROS 的水平。

本研究結果顯示，蜜環(huán)菌發(fā)酵液對睡眠剝奪小鼠的行為異常有很好的緩解作用，且能有效降低小鼠體內的氧化應激水平，為蜜環(huán)菌菌物藥的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持，也為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物開發(fā)提供選擇。