三益丹對(duì)大鼠心肌缺血的改善作用

田 歡支文冰李 曄張 紅陳志永劉 洋胡 靜岳寶森趙 鋒?

（1.西安市中醫(yī)醫(yī)院 藥劑科，陜西 西安710021； 2.陜西省中醫(yī)藥研究院 中藥研究所，陜西西安710003）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerotic heart disease，CAHD）是指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使血管腔狹窄或阻塞，因冠狀動(dòng)脈功能性改變（痙攣）導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死而引起的以胸痛、胸悶、短氣等主要臨床癥狀的心臟病，是心腦血管疾病里常見的一種。冠心病最主要的病變基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈供血不足導(dǎo)致的心肌缺血，而心肌則因缺血發(fā)生各種病理改變，急劇、短暫的缺血可引起心絞痛，持續(xù)、嚴(yán)重的心肌缺血?jiǎng)t可引起心肌壞死［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論中所說的冠心病、心絞痛、心肌梗死，屬于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論中的胸痹、心痛和真心痛的范圍［2］。三益丹是西安市中醫(yī)醫(yī)院傳統(tǒng)制劑，由人工牛黃、血竭、西洋參、延胡索、薄荷冰、冰片、硼砂、生石膏、人工麝香、珍珠粉十味藥材組成的成方制劑，臨床主要用于心血瘀阻引起的心前區(qū)悶痛不適（心絞痛），在臨床應(yīng)用已有四十多年，且療效顯著［3］。方中人工牛黃、麝香、薄荷冰、冰片開竅化濁［4-5］；延胡索、血竭活血化瘀，行氣止痛；石膏清熱瀉火；珍珠粉鎮(zhèn)心安神；西洋參補(bǔ)益心脾［5］。諸藥合用，共奏“三益”之效，故名三益丹，三益丹具有益氣養(yǎng)陰、通痹止痛、開竅化濁的功效。本研究擬用鹽酸異丙腎上腺素誘導(dǎo)，復(fù)制大鼠心肌缺血模型，進(jìn)而驗(yàn)證三益丹可緩解心血瘀阻型心前區(qū)悶痛不適的臨床療效。

1 材料

1.1 藥物和試劑 三益丹（自制）方中人工牛黃2.5 g、血竭1.5 g、西洋參5 g、延胡索6 g、薄荷冰9 g、冰片2 g、硼砂7.5 g、生石膏30 g、人工麝香0.4 g、珍珠粉4 g，上述十味藥材，均由陜西興盛德中藥飲片公司提供，陜西省中醫(yī)藥研究所張紅研究員鑒定為合格飲片。實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過前期的工藝優(yōu)化，按處方比例取方中各藥材，以總處方8%聚維酮（PVP-K30）為黏合劑，6% 羧甲基淀粉鈉（CMS-Na）為崩解劑，水為潤(rùn)濕劑，一定比例充分混合均勻，制備軟材后，采用擠出滾圓法，制備出丸重為41.23 mg，大小均一，工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控的三益丹丸劑；復(fù)方丹參滴丸（天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)180320）。鹽酸異丙腎上腺素（isproterenol，ISO；上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)L1708046）；生理鹽水注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)N18052508-2）；烏來(lái)糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20180308）；多聚甲醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20180308）；MDA（批號(hào)S0131）、NO（批號(hào)S0021）、IL-6（批號(hào)133141051126）、TNFα（批號(hào)240141131126）檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；CTn-I（批號(hào)190123031）、CK（批號(hào)190345121）、LDH（批號(hào)190840268）、AST（批號(hào)190940023）測(cè)定試劑盒（寧波普瑞柏生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 動(dòng)物 雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量（220±20）g，購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（陜）2012-003。在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下，溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度（60±5）%適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.3 儀器 ECG-6511 十二導(dǎo)心電圖機(jī)（上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（伯樂醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；Abbott i2000（雅培制藥有限公司）、Series 7600 生化儀（日本日立公司）；高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司）；RM2235 組織切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司）；HD-330 型攤片烤片機(jī)（湖北慧達(dá)儀器有限公司）；E200 顯微鏡（尼康影像儀器有限公司）；雅博包埋機(jī)（常州市雅博電子設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 造模及給藥 將60 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，復(fù)方丹參滴丸組（85 mg／kg）、三益丹低、中、高劑量組（37.5、75.0、150.0 mg／kg）。每組大鼠連續(xù)灌胃給藥14 d，1 次／d，正常組和模型組給予等量的生理鹽水。第12～14 天，灌胃給藥30 min 后，除正常組外，其他各組大鼠背部皮下多點(diǎn)注射ISO（85 mg／kg），1 次／d，連續(xù)注射3 d，時(shí)間間隔為24 h，正常組注射等量的生理鹽水，構(gòu)建大鼠心肌缺血模型［7］。三益丹丸臨床用藥量為成人每日900 mg；本研究依據(jù)陳奇主編的《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，大鼠（200 g）體表面積與成人（70 kg）體表面積比為0.018；75 mg／kg作為本研究的中劑量組，并分別減小和增大一倍得低、高劑量組（37.5、150 mg／kg）。

2.2 心肌缺血大鼠心電圖監(jiān)測(cè) 末次皮下注射ISO 前，20%烏來(lái)糖麻醉各組大鼠，行肢體Ⅱ?qū)碾妶D檢查，記錄大鼠心電圖，觀察ST 段的變化。

2.3 心肌組織病理學(xué)檢查 心電圖監(jiān)測(cè)完成后，繼續(xù)觀察30 min，經(jīng)腹部正中線切開，打開腹腔，立即取下心臟，生理鹽水中涮洗干凈，取左心尖組織，置于裝有4% 多聚甲醛溶液的離心管中固定48 h，采用HE 染色法觀察心肌組織的病理學(xué)變化情況。

2.4 大鼠血清因子檢測(cè) 心電圖監(jiān)測(cè)完成后，繼續(xù)觀察30 min，經(jīng)腹部正中線切開，打開腹腔，大鼠腹主動(dòng)脈采血，至無(wú)菌試管中，靜置2 h，3 500 r／min離心10 min，分離血清。

NO、MDA、TNF-α、IL-6 檢測(cè)，按照各試劑盒說明書中描述的方法操作，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中各指標(biāo)成分的活；肌鈣蛋白（cTn）采用Abbott i2000 生化分析儀測(cè)定，CK、LDH、AST 采用Series 7 600 分析儀測(cè)定。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 心肌缺血大鼠心電圖 ISO 誘導(dǎo)前各組大鼠心電圖ST 段比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。誘導(dǎo)后，正常組大鼠心電圖ST 段較之前無(wú)變化，與正常組比較，模型組大鼠ST 段值升高（P＜0.01）；與模型組比較，三益丹組大鼠心電圖ST段值降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 三益丹對(duì)心肌缺血大鼠心電圖ST 段的影響Fig.1 Effects of Sanyidan on ST segment of myocardial ischemic rats

圖2 各組大鼠心電圖Fig.2 Electrocardiogram for rats of each group

3.2 心肌組織病理學(xué) 正常組心肌細(xì)胞橫紋清楚，排列有序，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞壞死等病變；模型組橫紋模糊，排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞核減少，心肌組織損傷嚴(yán)重；復(fù)方丹參滴丸組、三益丹低、中、高劑量組均可看到較少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和不同程度細(xì)胞壞死現(xiàn)象。見圖3。

3.3 大鼠血清中cTn-I 水平 與正常組比較，模型組大鼠血清中cTn-I 水平升高（P＜0.01）。而給予復(fù)方丹參滴丸及不同劑量的三益丹進(jìn)行預(yù)保護(hù)，大鼠血清cTn-I 水平均下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

圖3 各組HE 染色結(jié)果（HE，×10）Fig.3 Resultant HE staining for each group（HE，×10）

圖4 三益丹對(duì)心肌缺血大鼠血清中cTn-I 水平的影響Fig.4 Effects of Sanyidan on serum cTn-I levels of myocardial ischemic rats

圖5 三益丹對(duì)心肌缺血大鼠血清中CK、LDH、AST 水平的影響Fig.5 Effects of Sanyidan on serum levels of CK，LDH，and AST in myocardial ischemic rats

3.4 大鼠血清中CK、LDH、AST 水平 與正常組比較，模型組大鼠血清中CK、LDH、AST 水平升高（P＜0.01）。而給予復(fù)方丹參滴丸及不同劑量的三益丹預(yù)保護(hù)，大鼠血清CK、LDH、AST 水平下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5。

3.5 大鼠血清中NO、MDA 水平 與正常組比較，模型組大鼠血清中NO、MDA 水平升高（P＜0.01）。而給予復(fù)方丹參滴丸及三益丹中、高劑量進(jìn)行預(yù)保護(hù)，大鼠血清NO、MDA 水平下降（P＜0.05）。見圖6。

3.6 大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平 與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.01）。而給予復(fù)方丹參滴丸及不同劑量的三益丹進(jìn)行預(yù)保護(hù)，除三益丹低劑量組IL-6 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）外，各給藥組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖7。

4 討論

圖6 三益丹對(duì)心肌缺血大鼠血清NO、MDA 水平的影響Fig.6 Effects of Sanyidan on serum levels of NO，MDA in myocardial ischemic rats

圖7 三益丹對(duì)心肌缺血大鼠血清TNF-α、IL-6 水平的影響Fig.7 Effects of Sanyidan on serum levels of TNF-α and IL-6 in myocardial ischemic rats

目前誘導(dǎo)心肌缺血模型的方法有冠脈結(jié)扎法、藥物誘導(dǎo)法。其中冠脈結(jié)扎法為經(jīng)典方法，但對(duì)動(dòng)物造成的手術(shù)創(chuàng)傷較大、死亡率和成本較高。而藥物誘導(dǎo)法簡(jiǎn)單、易行、省時(shí)、省力，多用于藥理、藥效學(xué)的研究，既可預(yù)防給藥亦可治療給藥。藥物誘導(dǎo)劑常用ISO 皮下或腹腔注射，也有少量文獻(xiàn)報(bào)道采用垂體后葉素舌下靜脈或腹腔注射［6-7］。ISO為β 受體激動(dòng)劑，可引起心肌強(qiáng)烈收縮，使心肌細(xì)胞耗氧量急劇增加［8］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，注射ISO的劑量對(duì)造模的程度影響較大，60 mg／kg 以下的劑量誘導(dǎo)造成的損傷大部分為可逆性損傷，存在自愈的現(xiàn)象；而85 mg／kg 及以上的劑量誘導(dǎo)造成的損傷多為不可逆損傷，基本可以排除機(jī)體自愈對(duì)藥理作用機(jī)制的影響。其中采用85 mg／kg 誘導(dǎo)心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ洼^多，最為成熟。因此，本實(shí)驗(yàn)采用85 mg／（kg／d）的ISO 劑量連續(xù)皮下注射3 d 復(fù)制心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

心肌缺血臨床表現(xiàn)為，心電圖ST 段抬高，其抬高程度可以反映心肌缺血和心肌損傷的嚴(yán)重程度，為心肌缺血損傷程度最直觀的標(biāo)志之一［9］。cTn 屬于一種心肌收縮的調(diào)節(jié)蛋白，大量存在于心肌細(xì)胞中，包括cTn-T、cTn-I、cTn-C 3 種不同基因的亞基，其中cTn-I 在心肌中有2 種存在形式，大多數(shù)以結(jié)合形式在肌原纖維中存在，少量以游離形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。在心臟受損早期，cTn-I 會(huì)以游離形經(jīng)過淋巴循環(huán)進(jìn)入血液。在心肌細(xì)胞受損后期，肌原纖維被不斷破壞，結(jié)合形式的cTn-I 會(huì)持續(xù)釋放，機(jī)體中cTn-I 水平會(huì)明顯升高，一般在發(fā)病14～24 h，cTn-I 水平達(dá)高峰，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。且cTn-I 指標(biāo)的敏感性、特異性不易受其他因素的影響，是反映心肌損傷的特異性標(biāo)志物，當(dāng)心肌組織出現(xiàn)微小區(qū)域壞死時(shí)，即可檢測(cè)到肌鈣蛋白的升高［10-12］。因此cTn-I 可作為評(píng)估心肌缺血或梗死中心肌損傷情況的一個(gè)重要指標(biāo)。CK、LDH、AST是人體3 種重要的心肌酶，正常人血清中心肌酶水平較少，當(dāng)心肌組織受到損傷時(shí)血管通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的酶發(fā)生外漏，導(dǎo)致血清中心肌酶含量增加，心肌酶含量的多少亦可反映心肌受損和壞死程度，也常用作心肌損傷的診斷標(biāo)志物［11-15］。當(dāng)心肌受損時(shí)，心肌組織會(huì)出現(xiàn)病理改變，心臟病理切片最能直觀的觀察心肌損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制ISO 致大鼠心肌缺血模型，通過觀察心肌缺血大鼠心電圖ST 段、心肌組織病理?yè)p傷程度，同時(shí)測(cè)定cTn-I、CK、LDH、AST 特異性指標(biāo)水平變化，發(fā)現(xiàn)三益丹能有效的降低心肌缺血大鼠心電圖ST段抬高程度，減輕心肌組織的病理?yè)p傷，明顯降低心肌缺血大鼠血清中cTn-I、CK、LDH、AST 的水平。從而表明三益丹對(duì)ISO 致大鼠心肌缺血有預(yù)防性保護(hù)作用。

MDA 為ROS 與細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，MDA 的水平可以反應(yīng)脂質(zhì)過氧化程度［13］。TNF-α 是一種單核因子，主要由血液?jiǎn)魏思?xì)胞和組織巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是重要的致炎因子，而且可直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡［16］。IL-6主要由活化的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，是重要的炎性因子和免疫調(diào)節(jié)因子［17］。當(dāng)心肌缺血發(fā)生時(shí)，可引起TNF-α、IL-6 等炎性因子釋放，促使中性粒細(xì)胞向損傷區(qū)域聚集，組織浸潤(rùn)增加，從而引發(fā)炎性反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生大量自由基，加劇組織損傷。有證據(jù)表明，當(dāng)NO 處在高濃度狀態(tài)下時(shí)，可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6 等的產(chǎn)生和釋放，TNF-α又能進(jìn)一步激活一氧化氮合酶（iNOS），從而產(chǎn)生更多的NO，形成正反饋循環(huán)調(diào)節(jié)，使炎性細(xì)胞因子以及NO 持續(xù)表達(dá)，致使炎癥反應(yīng)更持久、更劇烈［18］。心肌缺血損傷其發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)心肌缺血的發(fā)生具有重要意義［19］。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定心肌缺血大鼠血清中MDA、NO、TNF-α 和IL-6 水平，發(fā)現(xiàn)三益丹中高劑量組能顯著降低體內(nèi)炎癥因子的釋放和脂質(zhì)過氧化物的含量，表明改善心肌缺血的作用機(jī)理可能與抗氧化減少脂質(zhì)過氧化物、抗炎減少炎性因子釋放等因素有關(guān)，從而減輕心肌損傷。

綜上所述，三益丹對(duì)ISO 致大鼠心肌缺血有預(yù)防性的保護(hù)作用，為臨床用于心血瘀阻引起的心前區(qū)悶痛不適（心絞痛）提供依據(jù)，也證明了其療效的可靠性，為后期的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。同時(shí)證明其作用機(jī)理可能與抗氧化、抗炎等因素相關(guān)，詳細(xì)機(jī)理有待進(jìn)一步研宄。