HPLC 法同時(shí)測(cè)定健兒膏中8 種成分

李雪瑩魏運(yùn)姣?何小龍姜 濤

（1.武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢430033； 2.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢430075）

健兒膏為中成藥復(fù)方制劑，由黨參、炒白術(shù)、炒白扁豆、山藥、甘草、黃芪、茯苓、陳皮、炒麥芽、大棗10 味藥材組成，具有健脾益氣、和胃調(diào)中功效，主要用于小兒脾胃虛弱、運(yùn)化乏力所致的面黃肌瘦、厭食納呆、大便不調(diào)、身體虛弱、發(fā)育遲緩、自汗盜汗、貧血脈弱等營(yíng)養(yǎng)不良癥狀的治療［1］。

中藥及其復(fù)方制劑由多味藥材組成，而每味藥材又含有多種有效成分，故檢測(cè)單一成分難以全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量。健兒膏現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十冊(cè)，但未對(duì)方中藥味所含成分進(jìn)行定量測(cè)定，也未檢索到相關(guān)文獻(xiàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則［2-5］，采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定健兒膏中君藥黨參代表性成分黨參炔苷、紫丁香苷，臣藥炒白術(shù)主要有效成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，佐藥茯苓代表性成分去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的含有量，為該制劑質(zhì)量穩(wěn)定性和臨床療效一致性提供數(shù)據(jù)，也為加強(qiáng)其市場(chǎng)監(jiān)管提供參考。

1 材料

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；XP6 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號(hào)111978-201501，純度 99.9%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)111975-201501，純度99.9%）、黨參炔苷（批號(hào)111732-201607，純度100.0%）、紫丁香苷（批號(hào)111574-201605，純度95.2%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；茯苓酸（批號(hào)18030404，純度98.63%）、去氫茯苓酸（批號(hào)16032101，純度99.35%）對(duì)照品均購(gòu)于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；去氫土莫酸（批號(hào) 17041302，純度99.0%）、土莫酸（批號(hào)16040732，純度98.0%）對(duì)照品均購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司。健兒膏（250 g／瓶，批號(hào)18080396、18090172、19020251）購(gòu)于杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司。乙腈為色譜純（賽默飛世爾科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil Plus C18色譜柱；流動(dòng)相乙腈（A）-0.05% 磷酸（B），梯度洗脫（0～13.0 min，35.0% A；13.0～21.0 min，35.0%～40.0% A；21.0～34.0 min，40.0%～68.0% A；34.0～56.0 min，68.0%～ 90.0% A；56.0～65.0 min，90.0%～ 35.0% A ）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；0～21.0 min 在220 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ［6-7］，21.0～34.0 min 在266 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)黨參炔苷、紫丁香苷［8-9］，34.0～65.0 min在210 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸［10-11］；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、黨參炔苷、紫丁香苷、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸對(duì)照品適量，甲醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.174、0.158、1.172、0.076、0.432、0.228、0.292、0.534 mg／mL 的貯備液，各精密吸取2.5 mL，置于同一50 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得（質(zhì)量濃度分別為8.7、7.9、58.6、3.8、21.6、11.4、14.6、26.7 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 稱取本品約5.0 g，置于25 mL 具塞錐形瓶中，甲醇稀釋至刻度，超聲（200 W、40 kHz）處理10 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例及工藝分別制備缺白術(shù)、黨參、茯苓的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，色譜圖基線平穩(wěn)，各成分均能達(dá)到有效分離（分離度均＞1.5），理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均大于4 500，陰性無(wú)干擾，表明該方法系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituetns

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各2.0 mL，置于同一20 mL 量瓶中，甲醇制成線標(biāo)溶液1（白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ17.4 μg／mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ15.8 μg／mL、黨參炔苷117.2 μg／mL、紫丁香苷7.6 μg／mL、去氫土莫酸43.2 μg／mL、土莫酸22.8 μg／mL、去氫茯苓酸29.2 μg／mL、茯苓酸53.4 μg／mL），精密吸取適量，甲醇依次稀釋2、5、10、15、20 倍，分別制成線標(biāo)溶液2～6，精密吸取適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、黨參炔苷、紫丁香苷、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸峰面積RSD 分別為 1.16%、1.20%、0.95%、1.17%、1.05%、1.08%、1.11%、0.83%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一本品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、黨參炔苷、紫丁香苷、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸含有量RSD 分別為1.58%、0.71%、1.36%、1.84%、0.66%、1.27%、0.77%、1.46%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、黨參炔苷、紫丁香苷、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸峰面積RSD 分別為0.99%、1.05%、0.79%、0.86%、1.12%、1.03%、1.21%、0.92%，表 明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的本品9 份，每份2.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入對(duì)照品溶液（白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、黨參炔苷、紫丁香苷、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸質(zhì)量濃度分別為0.108、0.092、0.808、0.042、0.296、0.128、0.192、0.346 mg／mL）0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、黨參炔苷、紫丁香苷、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸平均加樣回收率分別為98.54%、97.91%、100.01%、96.99%、99.06%、97.06%、98.47%、99.59%，RSD 分別為1.28%、1.38%、0.99%、1.47%、0.83%、0.88%、1.10%、1.02%。

2.9 樣品含有量測(cè)定 取3 批本品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various consitituents（mg／g， n＝3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 健兒膏中黨參健脾益肺、養(yǎng)血生津，為方中君藥；炒白術(shù)健脾益氣，山藥補(bǔ)脾養(yǎng)胃，黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)，炒白扁豆化濕和中，共為臣藥；茯苓健脾滲濕，炒麥芽消食導(dǎo)滯，大棗益氣安神，陳皮理氣健脾，共為佐藥；甘草補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥，為使藥，諸藥合用，共奏健脾益氣、和胃調(diào)中之功效。參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物以君藥為主，同時(shí)兼顧臣藥、佐藥和使藥的原則，本實(shí)驗(yàn)選擇健兒膏方中君藥黨參、臣藥炒白術(shù)、佐藥茯苓進(jìn)行研究。黨參主要含有多糖、聚炔類、酚酸、木脂素等多種成分［12］，黨參炔苷是其保護(hù)胃黏膜的主要活性成分［13］，也是表征成分，而紫丁香苷具有抗疲勞、抗腦缺血、增強(qiáng)適應(yīng)性等藥理作用［14-15］；炒白術(shù)緩和燥性，增強(qiáng)健脾益氣功效，主要含有內(nèi)酯、揮發(fā)油，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ等內(nèi)酯類成分具有抗炎、調(diào)節(jié)胃腸道、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的功效［16］；茯苓主要含有多糖、三萜，其中去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸等三萜酸類成分，具有明顯的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用［17］。

3.2 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相甲醇-水［7］、乙腈-水［8］、甲醇-0.05% 磷酸［6］、乙腈-0.05%磷酸［10-11］、乙腈-0.05% 甲酸［9］，以各成分分離效果、峰形、色譜圖基線平穩(wěn)情況、分析時(shí)間為指標(biāo)，最終確定乙腈-0.05% 磷酸作為流動(dòng)相，按“2.1”項(xiàng)下比例進(jìn)行梯度洗脫。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定健兒膏中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、黨參炔苷、紫丁香苷、去氫土莫酸、土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的含有量，可用于該制劑更全面的質(zhì)量控制，也能為其相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的提高和完善提供參考依據(jù)。