一測多評法同時測定解郁膠囊中9 種成分

靳曉峰 魏譚軍馬偉麗 ?余曉暉

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州730000； 3.達州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川 達州635000）

解郁膠囊為甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院研制的醫(yī)院制劑（甘藥制字Z2016005），是由丹參、柴胡、石菖蒲、郁金、白芍等14 味藥材加工而成的中成藥，具有養(yǎng)心寧心、疏肝解郁的功效，臨床上主要用于心悸不寧、情緒低落、咽有梗阻感、煩躁易怒、少眠多夢、善嘆息、反應(yīng)遲鈍、脅肋脹痛等癥狀的治療［1-2］，可明顯改善抑郁模型大鼠行為學(xué)異常，增加腦內(nèi)單胺遞質(zhì)水平［3］，并且無明顯急性毒性反應(yīng)［2］；聯(lián)合帕羅西汀片治療抑郁癥時能明顯提高臨床療效，不良反應(yīng)較單用西藥低［1］。

中成藥復(fù)方制劑所含成分復(fù)雜，故多指標(biāo)質(zhì)量控制模式已廣泛應(yīng)用于其質(zhì)量監(jiān)控中，但該方法存在對照品不穩(wěn)定、價格昂貴等不足。一測多評法利用制劑中所含成分間存在的特定函數(shù)關(guān)系，通過測定1 種穩(wěn)定易得、價格低廉的成分含有量，來實現(xiàn)多種成分含有量的同時測定，有效地解決了待測成分不穩(wěn)定、對照品使用量大、檢驗成本高的難題，已得到了廣泛應(yīng)用。因此，本實驗采用該方法同時測定解郁膠囊中氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA的含有量，以期實現(xiàn)該制劑多指標(biāo)質(zhì)量評價模式。

1 材料

Agilent 1200 型液相色譜儀（美國Agilent 公司）；LC-2010 型液相色譜儀（日本島津公司）；AB135-S 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

芍藥苷（110736-201842，純度97.4%）、柴胡皂苷a（110777-201711，純度91.1%）、柴胡皂苷d（110778-201711，純度 95.8%）、丹酚酸 B（111562-201716，純度 94.1%）、丹參酮ⅡA（110766-201721，純度99.5%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；氧化芍藥苷對照品（39011-91-1，純度98.0%）購自成都曼思特生物科技有限公司；芍藥內(nèi)酯苷（39011-90-0，純度97.0%）、苯甲酰芍藥苷（38642-49-8，純度98.0%）、丹參素（76822-21-4，純度98.0%）對照品均購自上海純優(yōu)生物科技有限公司。解郁膠囊（每粒重0.5 g，批號171215、180629、190123）購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。乙腈為色譜純；磷酸、甲醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～12.0 min，15.0% A；12.0～29.0 min，15.0%～36.0% A；29.0～37.0 min，36.0%～51.0% A；37.0～56.0 min，51.0%～84.0%A；56.0～65.0 min，84.0%～12.0%A）；檢測波長230 nm（0～29.0 min，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷）［4-6］、210 nm（29.0～37.0 min，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d）［7］、280 nm（37.0～65.0 min，丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA）［8-11］；體積流量0.9 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA對照品適量，70% 甲醇稀釋成每1 mL 分別含0.278、1.252、2.344、0.198、0.152、0.118、0.176、3.102、0.356 mg 上述成分的貯備液，精密吸取適量，70%甲醇稀釋，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為13.9、62.6、117.2、9.9、7.6、5.9、8.8、155.1、17.8 μg／mL）。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取本品內(nèi)容物1.0 g，精密加入70% 甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（250 W、40 kHz）提取60 min，取出，冷卻至室溫，70%甲醇補足減失的質(zhì)量，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按照膠囊處方工藝分別制備缺白芍、柴胡、丹參的陰性樣品，按“2.3”項下方法制備，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰基線平穩(wěn)，峰形對稱，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各成分計均大于4 500，陰性無干擾。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項下貯備液適量，70%甲醇制成20 倍質(zhì)量濃度差的6 個線標(biāo)溶液A～F，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 相對校正因子測定 精密吸取“2.5.2”項下線標(biāo)溶液A～F，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以芍藥苷為內(nèi)標(biāo)，計算其他8 種成分相對校正因子，結(jié)果見表2。

2.5.4 精密度試驗 取同一供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA峰面積 RSD 分別為 0.81%、0.77%、1.65%、0.93%、1.02%、1.17%、1.09%、0.57%、0.70%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

表2 各成分相對校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5.5 重復(fù)性試驗 取同一批本品內(nèi)容物，按“2.3”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA含有量RSD 分別為 1.44%、0.56%、1.36%、1.60%、0.75%、1.88%、0.83%、1.26%、1.19%，表 明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA峰面積RSD 分別為0.77%、0.68%、1.61%、0.89%、0.92%、1.19%、1.10%、0.55%、0.71%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 加樣回收率試驗 取含有量已知的同一本品適量，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，稱取9 份，每份約0.5 g，精密吸取對照品溶液（氧化芍藥苷0.178 mg／mL、芍藥內(nèi)酯苷0.832 mg／mL、芍藥苷1.654 mg／mL、苯甲酰芍藥苷0.118 mg／mL、柴胡皂苷a 0.092 mg／mL、柴胡皂苷d 0.068 mg／mL、丹參素0.112 mg／mL、丹酚酸B 2.046 mg／mL、丹參酮ⅡA0.226 mg／mL）0.5、1.0、1.5 mL 各3 份（分別相當(dāng)于50%、100%、150%水平），按“2.3”項下方法制備9 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA平均加樣回收率分別為 97.46%、98.96%、99.80%、98.09%、97.61%、96.97%、98.48%、100.18%、97.98%，RSD分別 為1.03%、0.72%、0.68%、1.29%、1.51%、1.32%、0.95%、0.60%、1.11%。

2.6 相對校正因子影響因素考察

2.6.1 儀器、色譜柱 本實驗考察了Agilent 1200型、島津LC-2010 型色譜儀，以及Agilent Extend C18、Agilent Eclipse Plus C18、Hypersil ODS C18、Agilent Eclipse XDB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對相對校正因子的影響，結(jié)果見表3，可知均無明顯影響。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6.2 柱溫 本實驗考察柱溫25、30、35 ℃對相對校正因子的影響，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響。

表4 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.6.3 體積流量 本實驗考察體積流量0.8、0.9、1.0 mL／min 對相對校正因子的影響，結(jié)果見表5，可知均無明顯影響。

2.6.4 色譜峰定位 本實驗以相對保留時間為指標(biāo)定位色譜峰，并考察“2.6.1”項下儀器、色譜柱對其的影響，結(jié)果見表6，可知均無明顯影響。

2.7 樣品含有量測定 取3 批本品，按“2.3”項下方法各平行制備3 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，分別采用外標(biāo)法和一測多評法計算含有量，結(jié)果見表7，可知2 種方法所得結(jié)果相近（RSD＜2%）。

表5 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

表6 不同儀器、色譜柱對相對保留時間的影響Tab.6 Effects of different instruments and columns on relative retention time

表7 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.7 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 討論

3.1 待測成分選擇 解郁膠囊中丹參養(yǎng)血安神、清心除煩，為君藥；柴胡、石菖蒲、郁金行氣健脾，龍骨、牡蠣鎮(zhèn)靜安神，為臣藥；白芍、首烏藤養(yǎng)血柔肝，炒酸棗仁、五味子寧心安神，黃芪補氣固表，地黃養(yǎng)陰生津，麩炒枳殼化痰行氣，共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥，諸藥合用，共奏養(yǎng)心寧心、疏肝解郁的功效。參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物以君藥為主，兼顧臣、佐、使藥的原則，本實驗選擇君藥丹參代表性成分丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA，臣藥柴胡代表性成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，佐藥白芍主要成分氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷作為研究對象，并以對照品穩(wěn)定、價格相對較低的芍藥苷為內(nèi)標(biāo)。

3.2 流動相選擇 本實驗考察了流動相乙腈-水［7，12-14］、甲醇-水，發(fā)現(xiàn)后者洗脫時氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、柴胡皂苷d、丹參素分離效果不佳，故選用前者，但此時苯甲酰芍藥苷、丹參素、丹參酮ⅡA存在拖尾現(xiàn)象，故將水相改成磷酸［4-6，9-11］，可有效解決上述現(xiàn)象，而且各色譜峰分離效果較好。最終，選擇乙腈-0.1%磷酸作為流動相。

4 結(jié)論

本實驗建立一測多評法同時測定解郁膠囊中氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA的含有量，考察相對校正因子在不同高效液相色譜儀、色譜柱、柱溫、體積流量下的耐用性，并將測定結(jié)果與外標(biāo)法作比較，發(fā)現(xiàn)該方法穩(wěn)定可靠，可用于解郁膠囊的質(zhì)量控制與評價。