成纖維細(xì)胞生長因子受體2 過表達(dá)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用

王澤鑫，張佳欣，閆方泰，張寧，王紹清

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161000

成纖維細(xì)胞生長因子受體 （fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，結(jié)合成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF）參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，分化和生長等重要的生理過程。 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，多種癌細(xì)胞中FGFR 信號通路發(fā)生異常改變，包括基因的突變，擴(kuò)增，基因重排或異位和基因融合等[1]。

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌 （intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是來源于肝內(nèi)膽管上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率有增加的趨勢。 吉西他濱加順鉑是目前晚期ICC 治療的標(biāo)準(zhǔn)非治愈性化療方案， 目前缺乏有效的二線化療方案。現(xiàn)階段通過高通量分子生物學(xué)方法已經(jīng)鑒定出ICC中一些有效的基因治療靶點(diǎn)，如臨床上FGFR 基因異常表達(dá)的ICC 患者可能受益于FGFR 靶向治療[2]。 這些研究結(jié)果提示FGFR 信號通路在ICC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。 該研采用FuGENE HD 介導(dǎo)的FGFR2 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Hucct1 和HEK293T 細(xì)胞，觀察其在細(xì)胞水平對細(xì)胞增殖能力的影響， 為進(jìn)一步研究FGFR2 信號通路在ICC 靶向治療中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)基（ThermoFisher-11885，美國），胎牛血清（Gibco-16140071,美國），pcDNA3.1-TOPO-FGFR2（GenBank：FGFR2IIIb M97193.1） 質(zhì)粒由該課題組構(gòu)建并保存。鼠單克隆Bek 單克隆抗體（SC-6930，美國）、鼠抗 Actin（sc-8432,美國）、羊抗鼠 IgG 二抗（Invitrogen-35513，美國）、FuGENE HD Transfection Reagent（羅氏E2311， 美國），OptiMEM 低血清培養(yǎng)基 （Invitrogen-31985070，美國），特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天P0018AS，中國），CCK8 細(xì)胞增殖檢測試劑盒（碧云天-C0037,中國）。 其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純及進(jìn)口分裝。 主要儀器包括 CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱 （Thermo -8000，美國）、 YJ1452 型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠，中國），紫外可見分光光度計(jì)（UV1902PC，中國）等。

1.2 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染參照說書進(jìn)行，簡述如下。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d 以 4×105/mL 的密度接種于 6 孔板中，加入 2 mL 不含抗生素、含血清培養(yǎng)基，待Hucct1 和HEK293T 細(xì)胞融合達(dá)到85%融合時進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。FuGENE 轉(zhuǎn)染試劑與OptiMEM 培養(yǎng)基混合孵育5 min 后再加入適量質(zhì)粒（FuGENE HD：質(zhì)粒=3：1）混合孵育 15 min。 每 6 孔板加入適量混合液。 細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 Western Blot 檢測蛋白表達(dá)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h 后， 提取細(xì)胞總蛋白并定量。 進(jìn)行12% SDS-PAGE 電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉2 h。 轉(zhuǎn)印后PVDF 膜依次與一抗 （1：1 000）,二抗（1：5 000）進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)后進(jìn)行 ECL 發(fā)光,蛋白條帶表達(dá)通過Image J 軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 CCK8 檢測細(xì)胞增殖

CCK8 檢測細(xì)胞增殖按說明書進(jìn)行，分別在轉(zhuǎn)染后12 h，24 h 和 48 h 檢測 450 nm 波長的 OD 值。 細(xì)胞以1×104個/100 mL 加入 96 孔板中，每孔加入 10 μLCCK8溶液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK8 溶液的無細(xì)胞孔為空白對照組。 細(xì)胞放入在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后，使用酶標(biāo)儀在450 nm 進(jìn)行檢測OD 值。每個樣本設(shè)5 個副孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-TOPO-FGFR2 質(zhì)粒細(xì)胞內(nèi)FGFR2 蛋白表達(dá)增加

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h 后，Western Blot 檢測結(jié)果顯示：與未做處理的Hucct1 細(xì)胞相比， 轉(zhuǎn)染組Hucct1 細(xì)胞FGFR2 蛋白的表達(dá)量明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 與未做處理 HEK293T 細(xì)胞相比， 轉(zhuǎn)染組HEK293T 細(xì)胞內(nèi)FGFR2 蛋白的表達(dá)量也明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 各組細(xì)胞FGFR2 蛋白表達(dá)水平(±s)

表1 各組細(xì)胞FGFR2 蛋白表達(dá)水平(±s)

注：1 vs 2, P=0.006； 3 vs 4, P=0.001

組數(shù) 細(xì)胞類型 FGFR2 蛋白表達(dá)1 2 3 4 Hucct1 對照組Hucct1 轉(zhuǎn)染組HEK 293T 對照組HEK 293T 轉(zhuǎn)染組0.214±0.039 0.411±0.009 0.195±0.026 0.447±0.032

2.2 FGFR2 過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖能力

在轉(zhuǎn)染 FGFR2 質(zhì)粒后 12 h，24 h，48 h 后檢測各組細(xì)胞增殖能力。 結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后48 h，HEK293T 對照組 450 nm OD 值為（0.413±0.008）, 轉(zhuǎn)染后 HEK293T OD 值為 （0.676±0.033）（t=7.699，P＜0.000）； 對照組Hucct1 OD 值 （0.527± 0.015）, 轉(zhuǎn)染后 Hucct1 細(xì)胞 OD值（0.769±0.035）（t=6.205，P＜0.000）。結(jié)果提示，在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)FGFR2 基因具有促進(jìn)非腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞增殖的能力。

3 討論

FGFR 是一種跨膜酪氨酸激酶受體，在不同的細(xì)胞中參與細(xì)胞分化、生長、遷移、傷口愈合和血管生成等生物學(xué)過程。 該家族包括FGFR1,FGFR2,FGFR3HE FGFR4 四種。 已有研究證實(shí)FGFR 受體家族胞外區(qū)2個或3 個免疫球蛋白（Ig）樣結(jié)構(gòu)域可與多種FGF 配體結(jié)合并相互作用， 逐級催化酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域和具有多個酪氨酸磷酸化的羧基末端結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)， 激活多條下游信號通路而發(fā)揮作用[3]。 在人類，由于FGFR2 基因 mRNA 選擇性剪切，F(xiàn)GFR2 基因有 FGFR2IIIb 和FGFR2IIIc 兩種亞型，F(xiàn)GFR2IIIb 主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，F(xiàn)GFR2IIIc 主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞中。 通過基因測序鑒定出 ICC 中 FGFR2 基因亞型為 FGFR2IIIb 型[4]，該次研究選擇以人FGFR2IIIb mRNA 目標(biāo)基因構(gòu)建的pcD NA3.1-TOPO-FGFR2 表達(dá)質(zhì)粒為研究對象，在細(xì)胞水平上研究FGFR2 基因?qū)δ懝馨┘?xì)胞生物學(xué)功能的影響。

在許多研究報(bào)道中，F(xiàn)GFR2 家族是原癌家族成員之一，具有促進(jìn)腫瘤生長的作用，如乳腺癌中FGFR2 陽性率為68.67%(57/83）， 高于正常對照組; 而且FGFR2的高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展和臨床分期密切相關(guān)（P＜0.05）；Guy 報(bào)道，2%胃癌組織中存在FGFR2 基因擴(kuò)增， 并且FGFR2 基因的擴(kuò)增與患者不良預(yù)密切相關(guān)， 以上結(jié)果提示FGFR2 基因的擴(kuò)增是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[5-6]。 最近研究中報(bào)道FGFR2 基因的異常表達(dá)，如基因突變（p.N549H, p.N549K, p.V564F, p.E565A and p.K659M)、基因擴(kuò)增、融合（如 FGFR2-ACSL5 融合）與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切， 可能是一個新的基因治療靶點(diǎn)[4,7-10]。Ding 等[4]在動物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR2 基因融合具有促進(jìn)裸鼠膽管癌病人來源異種移植腫瘤的生長[68 d 腫瘤體積(1 210±127.9)mm3]，應(yīng)用小分子酪氨酸激酶Dovitinib 抑制劑后， 腫瘤體積較對照組明顯縮小[68 d 腫瘤體積(269.7±24.98）]，并且治療組腫瘤組織內(nèi)FGFR2 蛋白及其下游AKT 蛋白的表達(dá)較對照組表達(dá)下降（P＜0.01）,說明 FGFR2 信號通路與ICC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4]。

Rizvi S 等[7]研究發(fā)現(xiàn) YAP 基因通過激活 FGFR2 基因促進(jìn)Hucct-1 細(xì)胞的增殖，Md Wahiduzzaman[11]等研究通過基因敲除人間皮瘤細(xì)胞系 NCI-H2052 細(xì)胞FGFR2 基因的表達(dá)抑制了該細(xì)胞的增殖能力， 以上研究結(jié)果顯示FGFR 具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的能力。該研究得出相似的結(jié)果， 在膽管癌細(xì)胞中過表達(dá)FGFR2 具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。 在人膽管癌Hucct1 細(xì)胞和HEK293T 細(xì)胞中過表達(dá)FGFR2IIIb 基因后， 觀察其對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 瞬時轉(zhuǎn)染FGFR2 基因后，F(xiàn)GFR2 蛋白在 Hucct1 細(xì)胞 [（0.411±0.009）vs （0.214±0.039）] 和 HEK293T 細(xì)胞 [（0.447±0.032）vs （0.195±0.026）]中表達(dá)明顯增加，說明pcDNA3.1-TOPO-FGFR2在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染成功。在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)FGFR2 基因后，通過CCK8 檢測細(xì)胞增殖能力的變化， 研究結(jié)果顯示HEK293T 和 Hucct1 在轉(zhuǎn)染后 48 h 細(xì)胞增殖能力[（0.676±0.033），（0.769±0.035）]較未做處理的對照組相比[（0.413±0.008）,（0.527±0.015）]，在 450 nm OD 值明顯增加， 說明FGFR2 基因表達(dá)具有促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖的作用。 該次的研究在細(xì)胞水平驗(yàn)證FGFR2 基因的過表達(dá)具有促進(jìn)細(xì)胞生長的作用， 說明FGFR2 基因的過表達(dá)與ICC 發(fā)展有密切關(guān)系， 而且其發(fā)揮作用的機(jī)制可能與FGFR2 信號通路的激活有關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)GFR2 基因的過表達(dá)具有促進(jìn)正常細(xì)胞和人膽管癌細(xì)胞增殖的作用， 但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。 該次研究結(jié)果為FGFR2 基因在ICC發(fā)揮作用及作用機(jī)制的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。