喉癌患者PAC-1、CD62P 表達與臨床病理特征和復發(fā)的關(guān)系

胡誼容 田松明 趙福容

喉癌是我國最常見的頭頸部腫瘤之一[1]，喉癌的生存率、無癌生存期及喉功能的保留在很大程度上與喉癌診斷時所處的臨床分期密切相關(guān)[2]。早期喉癌5 年生存率較高，部分地區(qū)可達80%以上[3]。雖然近年喉癌在診治方面取得了長足發(fā)展，但是其復發(fā)率仍然較高，術(shù)后復發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移是導致喉癌治療失敗的主要原因，同時也是影響患者預后的主要因素[4]。有研究顯示，血小板活化狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中血小板粘附因子和釋放物質(zhì)起到了關(guān)鍵作用[5]。血小板表面血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 纖維蛋白原受體（platelet membrane glycoprotein Ⅱb/Ⅲa fibrin original receptor, PAC-1）和血小板P-選擇素（platelet P-selectin, CD62P）分別是血小板早期和晚期活化標志物，介導腫瘤細胞與血小板結(jié)合，刺激新生血管的形成，從而促進腫瘤細胞的種植、轉(zhuǎn)移、侵襲等[6]。但是鮮少見有研究分析PAC-1 和CD62P 與喉癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。本文擬通過對比喉癌患者和健康受試人群PAC-1和CD62P 表達的差異，結(jié)合患者的臨床病理特征和術(shù)后隨訪資料，以明確PAC-1 和CD62P 與喉癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復發(fā)的相關(guān)性。現(xiàn)報告如下。

資料與方法

1 一般資料

選擇2014 年1 月～2015 年12 月間在我院耳鼻咽喉科手術(shù)治療的116 例喉癌患者為實驗組，其中男性101 例，女性15 例；年齡42～71 歲，平均（56.6±5.9）歲。按2012 年UICC 進行臨床分期：I 期24 例，II 期41 例，III 期35 例，IV 期16 例，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移31 例，復發(fā)19 例。所有患者均經(jīng)喉部、頸部CT 及電子喉鏡檢查。入選標準：①經(jīng)病理學確診為鱗狀細胞癌；②術(shù)前未接受化療、放療或其他抗腫瘤治療；③患者簽署知情同意書。排除合并其他惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)、心腦血管疾病、嚴重肝腎功能不全、急慢性感染者。另外選取同時期我院健康體檢者60 例作為對照組（與入組患者年齡、性別構(gòu)成相匹配），其中男性52 例，女性8 例，年齡42～67歲，平均（54.2±7.4）歲。兩組一般資料比較，無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05），具有可比性。

2 方法

2.1 標本收集

所有患者抽取晨起空腹靜脈血5ml，收集到EDTA 抗凝試劑管中。以德國Hermle Z200A 小型離心機低速離心（3000r/min）15min，離心半徑10cm，離心后提取富含血小板血漿2ml 置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PAC-1 和CD62P 檢測

采用流式細胞術(shù)通過單抗免疫熒光標記測定特異性熒光抗體結(jié)合血小板陽性率來檢測PAC-1和CD62P 的表達水平。首先將富含血小板的血漿10μL 以及10μL CD61-PerCP、FITC-PAC-1、PECD62P 單克隆抗體（購自法國Immunotech 公司）加入實驗試管中，另加富含血小板的血漿10μL、FITC/PE 標記的IgG（購自法國Immunotech 公司）同型對照管，兩試管中各加入PBS 液30μl 混勻,室溫避光保存20min 后以1%多聚甲醛PBS 液固定。采用流式細胞儀（美國Coulter 公司）檢測，光源為488nm氦氖激發(fā)光，開始前以前向角、側(cè)向角的散射光信號對血小板群設(shè)門，同型對照作為陰性群，每次檢測10000 個血小板，結(jié)果以血小板表面表達PAC-1或CD62P 的陽性百分率表示。

3 隨訪

116 例患者均建立病例隨訪檔案，術(shù)后對腫瘤組織進行病理檢查，每3 個月通過電話或門診隨訪，記錄復發(fā)和轉(zhuǎn)移情況，隨訪≥2 年，未有患者死亡，隨訪率為100%。隨訪至2018 年9 月30 日。

4 統(tǒng)計學分析

所得數(shù)據(jù)均錄入SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間的比較采用方差分析，進一步組間兩兩比較以SNK-q 檢驗。采用單因素和多因素Logistics 回歸模型分析影響喉癌患者復發(fā)的因素。P<0.05 表明差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 兩組受試對象PAC-1 和CD62P 陽性表達率比較

喉癌患者的PAC-1 和CD62P 陽性表達率分別為（17.82±1.76）%和（22.87±3.13）%，明顯高于健康人群，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而且經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，實驗組患者PAC-1 表達和CD62P 表達呈正相關(guān)性（r=0.238，P<0.05）。見表1、圖1。

表1 兩組PAC-1 和CD62P 陽性表達率比較（±s）

表1 兩組PAC-1 和CD62P 陽性表達率比較（±s）

組別 例數(shù)（n） PAC-1(%) CD62P(%)實驗組 116 17.82±1.76 22.87±3.13對照組 60 3.79±0.54 18.31±1.95 t-60.227 10.291 P 值 - 0.000 0.000

2 喉癌患者PAC-1、CD62P 陽性表達率與患者病理特征的關(guān)系

喉癌患者的PAC-1 和CD62P 陽性表達率與患者腫瘤的T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N 分期）、遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，T 分期和N 分期越高，PAC-1 和CD62P 陽性表達率越高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。另外遠處轉(zhuǎn)移組PAC-1 和CD62P 陽性表達率高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移組，差異亦存在統(tǒng)計學意義（P<0.05）。喉癌患者PAC-1 和CD62P 陽性表達率與性別、年齡、臨床分型、分化程度無關(guān)（P>0.05）。見表2。

表2 116 例喉癌患者PAC-1、CD62P 陽性表達率與臨床病理特征的關(guān)系

3 喉癌患者PAC-1、CD62P 陽性表達率與喉癌復發(fā)的關(guān)系

隨訪期間有24 例患者復發(fā)，92 例患者未復發(fā)，復發(fā)率為20.69%。復發(fā)喉癌患者PAC-1、CD62P 陽性表達率分別為（17.02±0.85）%和（21.84±1.17）%，明顯高于未復發(fā)的喉癌患者，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。另外局部復發(fā)患者、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者、遠處轉(zhuǎn)移患者PAC-1、CD62P 陽性表達率比較未見統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見表3。

表3 喉癌患者PAC-1、CD62P 陽性表達率與復發(fā)的關(guān)系

4 單因素和多因素Logistic 回歸分析PAC-1 和CD62P 與喉癌復發(fā)的關(guān)系

以本研究中喉癌患者中性別、年齡、臨床分型、分化程度、T 分期、N 分期、遠處轉(zhuǎn)移以及PAC-1、CD62P 指標作為自變量，以復發(fā)（局部復發(fā)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移）進行單因素和多因素Logistic回歸分析，T 分期、N 分期、遠處轉(zhuǎn)移、PAC-1 和CD62P 是喉癌復發(fā)的獨立影響因素（P<0.05）。見表4。

表4 單因素和多因素Logistic 回歸分析PAC-1和CD62P 與喉癌復發(fā)的關(guān)系

討論

吸煙、飲酒、空氣污染、病毒感染、長期接觸石棉、芥子氣、鎳等化學物質(zhì)以及慢性炎癥等是喉癌發(fā)生最主要的危險因素[7]。與其他腫瘤一樣，喉癌是由上述多種環(huán)境因素和遺傳因素協(xié)同作用所致，是一種多基因參與、多階段的復雜病理過程[8]。目前臨床上主要采取手術(shù)和放化療手段，但是大量資料證實，喉癌血行和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率占初診患者的20%左右，在死亡患者中遠處轉(zhuǎn)移率更是高達65%以上[9]。因此如何預測患者預后，并選擇合理的治療方案具有重要的臨床價值。目前許多血清腫瘤標志物檢測廣泛應(yīng)用于喉癌的早期診斷及預后判斷，近來研究發(fā)現(xiàn)血小板活化與腫瘤的轉(zhuǎn)移復發(fā)密切相關(guān)[10]。

有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞可通過釋放炎性因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等誘導血小板活化，而活化的血小板表面糖蛋白通過與腫瘤細胞結(jié)合形成血小板-腫瘤細胞復合物，從而為腫瘤細胞的脈管浸潤及轉(zhuǎn)移提供了病理條件[11]。PAC-1 是血小板膜表面表達最為豐富的糖蛋白分子，屬于細胞表面粘附蛋白受體。血小板被激活后，PAC-1 的分子構(gòu)型發(fā)生改變，從而介導活化血小板上GPⅡb/Ⅲa 與纖維蛋白原結(jié)合，是引起血小板聚集的關(guān)鍵因子[12]。CD62P 又稱為血小板依賴性顆粒膜表面膜蛋白（PADGEM），同樣也是粘附分子家族的成員之一，參與血小板的粘附和聚集過程，其分子結(jié)構(gòu)為高度糖基化的單鏈跨膜蛋白，主要由血小板和血管內(nèi)皮細胞合成并儲存于血小板的α 顆粒和內(nèi)皮細胞的Weibel-Palade 小體內(nèi)[13]。血小板活化后可迅速導致PAC-1 和CD62P表達升高，其配體多為寡糖基團，如sialyl lewis x,sialyl lewis a, PSGL-1 等；腫瘤細胞表面可大量表達s-lewis x, s-lewis a 等寡糖，因此PAC-1 和CD62P可介導腫瘤細胞與活化內(nèi)皮細胞的粘附并促進腫瘤細胞穿越血管壁，從而參與腫瘤細胞的血行轉(zhuǎn)移。Qi 等[14]學者證實，激活的血小板在CD62P 的介導下，可與結(jié)腸癌、小細胞肺癌的結(jié)合并聚集在腫瘤細胞周圍，降低腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能力，從而為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移提供必不可少的條件。本研究也發(fā)現(xiàn)，喉癌患者的PAC-1、CD62P 陽性表達率明顯高于健康人群?？赡芘c升高的TNF-α 刺激血小板及內(nèi)皮細胞活化，α 粒和Weibel-Palade 小體迅速與質(zhì)膜融合，高表達PAC-1 和CD62P 有關(guān)。另外喉癌患者PAC-1 和CD62P 陽性表達率與患者腫瘤的T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N 分期）、遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。T 分期和N 分期越高，PAC-1 和CD62P 陽性表達率越高，同樣遠處轉(zhuǎn)移組患者PAC-1 和CD62P陽性表達率高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移組，這與其他相關(guān)腫瘤中報道的一致，表明喉癌患者體內(nèi)存在血小板活化，可能與喉癌細胞可分泌大量細胞因子、炎癥介質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶等特殊物質(zhì)從而促使血小板表面大量表達粘附因子有關(guān)。除此以外，Huang 等[15]還發(fā)現(xiàn)血小板GPⅡb/Ⅲa 受體拮抗劑精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽可通過抑制血小板-腫瘤細胞復合物的形成，從而抑制大鼠肺鱗狀細胞癌株的轉(zhuǎn)移。基于上述藥理作用分析，我們進一步對比了復發(fā)患者和未復發(fā)患者PAC-1 和CD62P 陽性表達率的差異。結(jié)果也證實PAC-1 和CD62P 高表達與喉癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上所述，PAC-1 和CD62P 陽性表達率與喉癌患者T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時可作為喉癌局部復發(fā)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移的預測指標。