木聚糖對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血糖的其腸道產(chǎn)短鏈脂肪酸的影響

張小東，黃秀靜，王小燕，周小梅，何德華

（桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林）

0 引言

據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)（International Diabetes Federation，IDF）報(bào)道，2017年全球糖尿病受累人群達(dá)4.25億，預(yù)計(jì)到2035年這一數(shù)字將增至5.92億[1]。有研究表明，通過合理膳食能夠有效調(diào)節(jié)血糖水平，預(yù)防由于糖尿病導(dǎo)致的高脂血癥疾病的發(fā)生[2-4]。Muhammad U等人（2016）在對(duì)糖尿病大鼠補(bǔ)充益生菌、益生素和合生素食物的腸道微生物的分子分析的研究表明在食物中添加益生菌、益生素和合生素能有效的降低糖尿病大鼠的血糖[5]。

Julia Bollrath等人（2013）基于膳食纖維在腸道分解成的短鏈脂肪酸能與腸道Treg細(xì)胞表達(dá)的受體蛋白配基結(jié)合，發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用，從而控制多種自身免疫性疾病與炎癥性腸病的發(fā)生，在Science雜志上發(fā)出“給你的Treg細(xì)胞飼喂更多纖維”的呼吁[6]。而木聚糖是禾本植物半纖維素的主要成分，是除纖維素外含量最為豐富的天然細(xì)胞壁多糖，是人類可從作物秸稈中獲取的豐富可再生資源[7]，具有能充分滿足人類社會(huì)大規(guī)模持續(xù)需求的資源優(yōu)勢(shì)的膳食纖維。那么它對(duì)于患糖尿病大鼠的血糖是否調(diào)節(jié)影響呢？其對(duì)糖尿病大鼠腸道產(chǎn)這種可以發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控的短鏈脂肪酸的產(chǎn)量是否存在影響呢？我們將對(duì)其進(jìn)行研究。

本研究選擇具有資源優(yōu)勢(shì)的木聚糖，研究其對(duì)糖尿病大鼠的血糖及其產(chǎn)短鏈脂肪酸的影響。試圖了解木聚糖對(duì)Ⅱ型糖尿病血糖的影響及對(duì)患病狀態(tài)下的大鼠腸道代謝產(chǎn)短鏈脂肪酸的影響。為木聚糖作為優(yōu)質(zhì)的膳食纖維提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器設(shè)備

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重（150±20）g，桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK桂2013-0001。

普通飼料（34%玉米、32%面粉、13%麩皮、17%豆粕、4%魚粉、1%鹽）（南京盛民科研動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)）、高脂飼料（20%豬油、1%膽固醇、0.2%膽鹽、20%砂糖、58.8%普通大鼠飼料） （南京盛民科研動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)）、鏈脲佐菌素（streptozotocin STZ）（Sigma）、木聚糖（中科院雁山植物研究所提供）。

臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf 5415R）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）（美國(guó)Agilent7890A-5975C型）、氣相色譜柱（DBFFAP122-3232型）、血糖儀（強(qiáng)生穩(wěn)豪培優(yōu)）及配套血糖試紙。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 糖尿病模型構(gòu)建

60只大鼠飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，標(biāo)準(zhǔn)籠喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。本研究一共分為四組，即木聚糖糖尿病組大鼠（xyLandiabetes）（10只）、糖尿病組（diabetes）大鼠（10只）、木聚糖對(duì)照組（xylan-control）大鼠（10只）和對(duì)照組（control）大鼠（10只）。我們采用高脂高糖飼料飼喂8周聯(lián)合小劑量腹腔注射25mg/kg鏈脲佐菌素（STZ）的方法制得Ⅱ型糖尿病模型。以連續(xù)兩周空腹血糖大于7.8mmol/L和餐后2h血糖11.1-32.0mmol/L為建模成功的Ⅱ型糖尿病大鼠[8]。并對(duì)以上4組大鼠進(jìn)行為期12周的飲食干預(yù)，期間糖尿病組大鼠和對(duì)照組大鼠用普通飼料喂養(yǎng)，而木聚糖糖尿病組大鼠和木聚糖對(duì)照組大鼠在普通飼糧中添加游離木聚糖（2.38g/kg·d）喂養(yǎng)。

1.2.2 血糖的測(cè)定

每周對(duì)木聚糖糖尿病組（xyLan- diabetes）、糖尿病組（diabetes）、木聚糖對(duì)照組（xylan-control）和對(duì)照組（control）這四組大鼠禁食10-12h，尾靜脈采血，采用血糖儀和試紙片分別測(cè)定其空腹血糖和口服葡糖（2g/kg）后2h的血糖值。

1.2.3 鼠便中短鏈脂肪酸的測(cè)定

為消除試驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體間糞便的差異，用大鼠籠分開飼養(yǎng)收集飲食干預(yù)12周后的木聚糖糖尿病組（xyLan-diabetes）、糖尿病組（diabetes）、木聚糖對(duì)照組（xylan-control）和對(duì)照組（control）這四組中每只大鼠的新鮮糞便樣品，經(jīng)處理后進(jìn)行GC-MS分析。（色譜柱：DB-FFAP毛細(xì)管柱，0.25m內(nèi)徑×30m柱長(zhǎng)×0.25μm膜厚；質(zhì)譜條件：掃描范圍200-800 m/z，NIST05a譜庫(kù)）。根據(jù)各樣品的質(zhì)譜，在計(jì)算機(jī)色譜工作站上進(jìn)行檢索，并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖集對(duì)照，初步鑒定各糞便樣品的化學(xué)成分。然后選擇與標(biāo)準(zhǔn)譜集關(guān)聯(lián)度較高的組分，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行氣相色譜分析比較，最后確定該化合物的成分。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad Prim6進(jìn)行分析。其中短鏈脂肪酸、第12周的空腹血糖值和餐后2小時(shí)血糖值采用Column中OneOne -Way ANOVA方法進(jìn)行分析，每周空腹血糖值和餐后2小時(shí)血糖值采用XY中Linear regression方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 血糖

我們的研究結(jié)果顯示，對(duì)木聚糖糖尿病組（xyLan-diabetes）、糖尿病組（diabetes）、木聚糖對(duì)照組（xylan-control）和對(duì)照組（control）這四組經(jīng)過為期12周的飲食干預(yù)。在這12周中，與未添加木聚糖飲食干預(yù)的糖尿病組大鼠相比，飲食中添加游離的木聚糖的木聚糖糖尿病組大鼠的空腹血糖值（圖1）和餐后2h的血糖值（圖2）隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，其血糖值都明顯低于糖尿病大鼠組。且飲食干預(yù)12周后，木聚糖糖尿病組大鼠空腹血糖值極顯著低于糖尿病組大鼠的空腹血糖（P＜0.01）（圖3），木聚糖糖尿病組大鼠餐后2h的血糖值低于糖尿病組，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4）。以上的研究結(jié)果顯示，木聚糖可極顯著降低糖尿病大鼠的空腹血糖值，具有調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血糖的作用。

2.2 鼠便中短鏈脂肪酸組分測(cè)定及結(jié)果分析

對(duì)以上四組大鼠糞便分別進(jìn)行色譜分析，都得到了3個(gè)主要的組分其總離子流圖，經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)，對(duì)3個(gè)色譜峰加以分析、確認(rèn)，最后鑒定這3個(gè)化合物分別為乙酸（acetic acid），丙酸（propionic acid）和丁酸（butyric acid）。

將以上測(cè)得的短鏈脂肪酸含量采用GraphPad Prism6繪制柱形圖和T檢驗(yàn)，結(jié)果顯示木聚糖組比對(duì)照組的乙酸含量明顯增多，且存在差異（P＜0.05），木聚糖糖尿病組的乙酸含量比糖尿病組乙酸含量明顯增多，且存在極顯著差異（P＜0.0001）（圖5）；木聚糖糖尿病組的丙酸含量比糖尿病組丙酸含量明顯增多，且存在極顯著差異（P＜0.0001）（圖6）；木聚糖糖尿病組的丁酸含量比糖尿病組丁酸含量明顯增多，且存在極顯著差異（P＜0.0001）（圖7）；我們的研究結(jié)果表明木聚糖可以顯著提高糖尿病大鼠糞便中短鏈脂肪酸（包括乙酸、丙酸、丁酸）的產(chǎn)量。

圖1 各組大鼠隨著飲食干預(yù)的空腹血糖變化

圖2 各組大鼠隨著飲食干預(yù)周數(shù)餐后2小時(shí)血糖變化

圖3 飲食干預(yù)12周后各組的空腹血糖

圖4 飲食干預(yù)12周后的各組餐后2小時(shí)血糖（

圖5 木聚糖糖尿病組、糖尿病組、木聚糖對(duì)照組和對(duì)照組大鼠的乙酸含量

圖6 木聚糖糖尿病組、糖尿病組、木聚糖對(duì)照組和對(duì)照組大鼠的丙酸含量

圖7 木聚糖糖病組、糖尿病組、木聚糖對(duì)照組和對(duì)照組大鼠的丁酸含量

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠飼料中添加游離的木聚糖進(jìn)行為期12周的飲食干預(yù)后，可以顯著降低糖尿病大鼠的空腹血糖值（P＜0.01）（圖3），且可極顯著提高糖尿病大鼠糞便中短鏈脂肪酸（包括乙酸、丁酸和丙酸）的產(chǎn)量（P＜0.001）（圖5、6、7）。而目前研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸具有調(diào)節(jié)血糖、與單糖分子雜合進(jìn)行藥物控釋等重要作用，在對(duì)腸道功效方面，短鏈脂肪酸不僅具有氧化供能的作用，而且還有維持水電解質(zhì)平衡、抗病原微牛物及抗炎、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道功能、調(diào)節(jié)免疫等重要作用[6,9,10]。這提示木聚糖調(diào)節(jié)空腹血糖的作用機(jī)制很有可能通過高產(chǎn)的短鏈脂肪酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究顯示的木聚糖具有降血糖并可高產(chǎn)短鏈脂肪酸的性能為木聚糖作為優(yōu)質(zhì)的膳食纖維提供了理論依據(jù)。但木聚糖極顯著提高糖尿病大鼠的短鏈脂肪酸的產(chǎn)量以及降血糖的分子機(jī)制有待于我們進(jìn)一步的研究。