貴州天冬煮制工藝影響因素的初步研究

劉婭琴，王先菊，張敏，李瑋，杜洪志，吳珊珊

（貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽）

0 引言

天冬為百合科植物天冬 Asparagus cochinchinensis （Lour.）Merr.的干燥塊根。甘、苦，寒。歸肺、腎經(jīng)。具有養(yǎng)陰潤燥，清肺生津的功效[1]。主產(chǎn)于貴州、云南、四川、重慶、湖南等地，以貴州產(chǎn)天冬產(chǎn)量最大、品質(zhì)最佳[2]。主要有甾體皂苷類、多糖類、氨基酸類等成分[2]，現(xiàn)代研究表明，這些成分具有抗衰老、抗癌、抗腫瘤、治療白血病、鎮(zhèn)咳、平喘、增強免疫等作用[3-10]。目前天冬的產(chǎn)地加工方法較混亂。天冬傳統(tǒng)的采收初加工，主要包括采收、分檔、除雜、水洗、煮制、去皮、干燥等步驟[11]。2015版《中國藥典》天冬有蒸或煮兩種產(chǎn)地加工方式，但缺乏明確的參數(shù)。有研究表明，最佳煮制時間為15min[12]；也有研究顯示，煮制40min飲片得率較高，水量對天冬浸出物有影響，干燥方式和溫度不同，得到的藥材質(zhì)量也有較大差別[13]。前期實驗優(yōu)化了貴州產(chǎn)天冬的蒸制工藝，本研究進一步對貴州產(chǎn)天冬的煮制工藝影響因素進行研究。

1 材料

1.1 儀器

紫外-可見分光光度計（型號GBC cintra 20，澳大利亞照生公司）；ME204E型萬分之一電子天平（上海梅特勒-托利多）；十萬分之一電子天平（型號AUW220D，島津）；旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀（型號RE-52A，上海亞榮）；超聲清洗機（型號 HS10260D，天津恒奧）；電熱鼓風干燥箱（型號CS101-1C，重慶四達）。

1.2 試劑與試藥

天冬藥材采自貴州省安順市關(guān)嶺縣，經(jīng)貴陽中醫(yī)學院生藥教研室周漢華老師鑒定為百合科植物天冬Asparagus cochinensis（Lour.） Merr.的根。菝葜皂苷元對照品（批號：110744-200509）、葡萄糖對照品（批號110833-200503）均購自中國藥品生物制品檢定所；水為蒸餾水；其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素考察

以天冬總皂苷、多糖為指標，考察煮制時間、水量對天冬煮制工藝的影響。

（1）不同煮制時間 取凈制的鮮天冬8份，每份200g，分別置鍋中煮5、10、15、20、25、30、35、40min后，取出剝皮，用清水漂洗，置60℃烘箱中烘至全干，進行粉碎，過80目篩。測定總皂苷、多糖。

（2）不同煮制水量 取凈制的鮮天冬10份，每份200g，分別用2、4、6、8、10、12、14、16、18、20倍水置鍋中煮15min，取出剝皮，用清水漂洗，置60℃烘箱中烘至全干，進行粉碎，過80目篩。測定總皂苷、多糖。

2.2 對照品溶液制備

（1）總皂苷 將菝葜皂苷元對照品置于五氧化二磷減壓干燥器中，干燥12 h后，精密稱取12.70 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇制成0.2540 mg/mL的溶液。

（2）多糖 精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖60mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解稀釋，制成0.6 mg/mL的溶液。

2.3 各指標物質(zhì)提取

（1）總皂苷 精密稱取天冬粉末，約0.5g，置于索氏提取器內(nèi)，加100 mL氯仿脫脂2h，揮干溶劑，再加甲醇100 mL，80℃回流提取至無色，取出藥包，回收甲醇，加10mL蒸餾水溶解，用水飽和的正丁醇萃取4次（正丁醇分別為15mL、10mL、10mL、10mL），合并正丁醇部分，用正丁醇飽和的水洗滌，減壓回收至干，殘渣用甲醇溶液定容至100mL，即可。

（2）多糖 精密稱取天冬粉末，約0.25 g，置于燒瓶中，加入80%乙醇100mL，80℃回流提取2h，趁熱過濾，揮干溶劑，將濾渣和濾紙同置于燒瓶中，加80mL蒸餾水，提取2次，每次2h，合并濾液，置于200mL容量瓶中，定容，搖勻即可。

2.4 各指標含量測定法

（1）總皂苷 精密吸取各總皂苷元提取液1 mL于顯色管中，揮干甲醇，加10 mL高氯酸，搖勻，在65℃水浴加熱顯色15 min后取出，在冰水浴中冷卻15 min，于紫外可見分光光度計波長310 nm處測定吸光度。

（2）多糖 精密吸取各多糖提取溶液2 mL，在冰水浴中緩緩滴加0.2%的蒽酮-硫酸溶液8 mL，搖勻，再置于沸水浴中保持10 min后取出，立即置于冰水浴中保溫10 min，于紫外可見分光光度計波長620nm處測定吸光度。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關(guān)系考察

（1）總皂苷 精密吸取對照品溶液0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL、1.3 mL、1.5 mL、1.7 mL于比色管中，揮干溶劑，加高氯酸10 mL，搖勻，65℃水浴加熱顯色15min，取出，在冰水浴中冷卻15min，搖勻，以同法平行處理的空白溶劑為空白，在310nm處測定吸收值。以菝葜皂苷元質(zhì)量（mg）為橫坐標，吸收值A為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：y =1.6145x- 0.015，r = 0.9992，菝葜皂苷元在0.1778～ 0.4318 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

（2）多糖 精密吸取葡萄糖對照品溶液1.5 mL、1.8 mL、2.1 mL、2.4 mL、3.0 mL、3.3 mL，分別置于25 mL比色管中，定容，分別精密量取2mL于比色管中，在冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液8mL，搖勻，再置沸水浴中保持10分鐘后取出，立即置冰水浴中保溫10分鐘，空白組用2 mL蒸餾水+8 mL0.2%蒽酮-硫酸，于620nm波長處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：A=5.953C+0.0708，r=0.9991，結(jié)果表明葡萄糖對照品在0.036～0.0792mg/mL線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗

精密吸取供試品溶液，按2.4項下的顯色條件進行測定。多糖和總皂苷吸光度的RSD值分別為1.65%，2.35%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗

精密稱取同一處理方法的天冬粉末6份，按2.3項制備供試品溶液，按2.4項下的顯色條件對多糖，總皂苷進行測定。多糖和總皂苷吸光度的RSD值分別為2.87%，2.62%，結(jié)果表明，測定方法重現(xiàn)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗

精密稱取同一處理方法的天冬粉末1份，按2.3項制備供試品溶液，按2.4項下的顯色條件，分別在0 h、0.5 h、1.5h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h和5 h進行吸光度測定，記錄試驗結(jié)果。多糖和總皂苷吸光度的RSD值分別為1.95%，1.38%，結(jié)果表明，供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率試驗

（1）多糖 精密稱取也知含量的天冬樣品6份于燒瓶中，每份約0.125 g。精密稱取葡萄糖對照品0.15550 g，用蒸餾水定容到25 mL，即得6.22 mg/mL的對照品溶液。分別精密吸取葡萄糖對照品溶液1毫升，加入上述每個燒瓶中，按2.3項方法制備供試溶液，按“2.4”項進行測定。實驗平均回收率為100.42%，RSD為2.24%。

（2）總皂苷，精密稱取已知含量的天冬樣品6份于燒瓶中，每份約0.25g。精密稱取菝葜皂苷元對照品0.09170g，用甲醇定容到50毫升，即得1.834mg/mL的對照品溶液。分別精密吸取菝葜皂苷元對照品溶液加8毫升入上述每個燒瓶中，按“2.3”項制備樣品溶液，按“2.4”項下條件進行測定，計算回收率。加樣回收率試驗平均回收率為101.45%，RSD為2.24%。

2.6 不同煮制時間對天冬多糖、總皂苷含量的影響

精密稱取2.1項預備好的樣品粉末適量，按2.3項制備不同煮制時間的供試品溶液。按2.4項顯色條件，測定吸光度，計算各樣品中天冬總皂苷、多糖的含量，結(jié)果見表1。

表1 不同煮制時間天冬總皂苷、多糖含量（n=3)

經(jīng)方差分析，煮制不同時間天冬總皂苷含量的P值為0.002，有顯著性差異。煮制不同時間天冬多糖含量的P值為0.06，無顯著性差異。煮制40min天冬總皂苷含量最高，煮制35min天冬多糖含量最高。煮制35min和40min天冬總皂苷含量有顯著性差異。結(jié)果表明，以天冬總皂苷、多糖含量為指標，煮制40min最佳。

2.7 不同煮制水量對天冬多糖、總皂苷含量的影響

精密稱取2.1項預備好的樣品粉末適量，按2.3項制備不同煮制水量的供試品溶液。按2.4項顯色條件，測定吸光度，計算各樣品中天冬總皂苷、多糖的含量，結(jié)果見表2。

表2 不同煮制水量天冬總皂苷、多糖含量（n=3）

經(jīng)方差分析，不同煮制水量的天冬總皂苷和多糖含量的P值分別為0.001、0.000，有顯著性差異。6倍煮制水量天冬總皂苷含量最高，8倍煮制水量天冬多糖含量最高。6倍和8煮制水量天冬總皂苷含量無顯著性差異，但多糖含量有顯著性差異。結(jié)果表明，以天冬總皂苷、多糖含量為指標，以8倍煮制水量最佳。

3 討論

實驗以天冬多糖、總皂苷含量為指標，考察了不同煮制時間、水量對貴州產(chǎn)天冬的影響，結(jié)果表明以8倍水量煮制或煮制40min時，天冬多糖和總皂苷含量均較高。同時以天冬多糖為指標進行實驗，實驗結(jié)果顯示：直接干燥生品與未剝皮煮、未剝皮蒸比較有顯著性差異，經(jīng)蒸、煮后，天冬多糖含量較直接干燥生品高；未剝皮煮和剝皮煮有顯著性差異，未剝皮煮含量較剝皮煮高，但未對總皂苷作研究；前期實驗證明溫度為80℃下烘干得到的天冬多糖的含量最高。

研究結(jié)果表明不同煮制時間、水量、是否剝皮、干燥溫度等因素對貴州產(chǎn)天冬的多糖和總皂苷含量均有影響。由于試驗條件和試驗時間的限制，不同煮制時間、煮制水量、是否剝皮、干燥方式及溫度等對貴州天冬的浸出物、其它有效成分及藥效等的影響，還有待進一步研究。下一步將用正交和綜合評分法優(yōu)選貴州產(chǎn)天冬的煮制工藝。

注：方法學考察和指標成分提取，測定來源于前期實驗。