乳消Ⅲ加味方對(duì)乳腺增生模型大鼠血液流變學(xué)及PCNA 表達(dá)的影響

張婷婷，王 蘋(píng)，張建偉

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122）

乳腺增生病是育齡期婦女的常見(jiàn)病和多發(fā)病，且呈年輕化趨勢(shì)。 在上個(gè)世紀(jì)，專家學(xué)者提出了乳腺癌的“多階段發(fā)展模式”，即“正?！錾堑湫驮錾话?rùn)性癌”的變化模式，認(rèn)為在出現(xiàn)原位癌之前，這個(gè)發(fā)展進(jìn)程是可逆的。 因此，積極的干預(yù)乳腺增生病向乳腺癌轉(zhuǎn)變有著重要的現(xiàn)實(shí)意義［1］。 乳消Ⅲ號(hào)膠囊是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有活血化瘀、行氣止痛、補(bǔ)血養(yǎng)陰、軟堅(jiān)散結(jié)的功效，臨床上用于治療乳腺增生病方面療效顯著。 本實(shí)驗(yàn)嘗試通過(guò)分析乳消Ⅲ號(hào)膠囊組方配伍特點(diǎn)并適當(dāng)加味，觀察實(shí)驗(yàn)大鼠血液流變學(xué)及乳腺上皮組織增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）表達(dá)的影響，以探討乳消Ⅲ加味方治療乳腺增生病的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 72 只SPF 級(jí)SD 雌性健康未孕大鼠，10 周齡，體質(zhì)量（196.78±5.78）g，購(gòu)買(mǎi)于上海市西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。 實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所為福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK（閩）2009-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 乳癖消片（遼寧好護(hù)士藥業(yè)有限責(zé)任公司），以生理鹽水研磨配成乳癖消片混懸液。乳消Ⅲ加味方（當(dāng)歸、桃仁、延胡索、赤芍、生地黃、川楝、浙貝母、沒(méi)藥、乳香、紅花、牡蠣、柴胡、淫羊藿）由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院藥房提供。 將生藥經(jīng)蒸餾水浸泡1 h，文火煎煮2 次，每次60 min，取汁合并，4 層紗布過(guò)濾2 次，70～80 ℃水浴濃縮為240%濃度的藥液（含生藥2.4 g／mL），冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 苯甲酸雌二醇注射液（1 mL∶2 mg，上海通用藥業(yè)股份有限公司）；黃體酮注射液（20 mg／mL，浙江仙琚制藥股份公司）；10%水合氯醛溶液；中性樹(shù)膠、多聚賴氨酸、S-P 試劑盒、PCNA抗大鼠（福州邁新生物科技有限公司）；蘇木素染色（南京建成生物工程研究所）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組12 只、造模組60 只。 造模組采用雌、孕激素序貫法造模，按體質(zhì)量0.5 mg／（kg·d）于大鼠后肢后外側(cè)肌肉注射苯甲酸雌二醇，每日1 次，左右交替，連續(xù)25 d；繼而用黃體酮注射5 mg／（kg·d），每日1 次，連續(xù)5 d；正常對(duì)照組肌肉注射生理鹽水0.1 mL／只，每日1 次，連續(xù)30 d。

2.2 分組與干預(yù) 雌孕激素聯(lián)合給藥造模完成后，實(shí)驗(yàn)組再隨機(jī)分為模型組、乳癖消片組、乳消Ⅲ加味高劑量組（高劑量組）、乳消Ⅲ加味中劑量組（中劑量組）、乳消Ⅲ加味低劑量組（低劑量組），每組動(dòng)物12 只。 高、中、低劑量組分別按25、12.5、6.25 g／（kg·d）予生藥提取液灌胃；乳癖消片組按成人劑量9 粒（2.88 g／d）的6.25 倍，即按0.3 g／（kg·d）予乳癖消片混懸液灌胃；模型組與正常對(duì)照組予等量生理鹽水灌胃，均持續(xù)灌胃干預(yù)30 d。

2.3 標(biāo)本采集 大鼠灌胃30 d 后，禁食24 h，通過(guò)隨機(jī)抽取方式，每組隨機(jī)取8 只實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)。按1 mL／kg 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，采用腹主動(dòng)脈取血2～3 mL，隨后加入肝素抗凝，低溫保存，送至福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬國(guó)醫(yī)堂檢驗(yàn)科檢驗(yàn)。 取血后處死大鼠，游標(biāo)卡尺測(cè)量第二對(duì)乳頭直徑，經(jīng)乳頭向基底部最大面積取下第二對(duì)完整乳房組織，先用肉眼大致觀察組織外表并稱重，再用10%福爾馬林溶液固定，備用。

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 血液流變學(xué)檢測(cè) 采用FASCO-3020B 全自動(dòng)血液流變儀，檢測(cè)血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、全血黏度、全血還原黏度等血液流變學(xué)指標(biāo)。

2.4.2 病理學(xué)觀察 常規(guī)取材后、通過(guò)固定、脫水、石蠟包埋切片，采用HE 染色法進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)乳腺組織切片的組織學(xué)變化進(jìn)行觀察。

2.4.3 PCNA 檢測(cè) 采用S-P 法，對(duì)乳腺上皮組織PCNA 蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 先將部分切片的乳腺組織脫蠟水化，加入20 g／mL 蛋白酶K 消化20 min，3% H2O2阻斷，隨后再加入PCNA 一抗過(guò)夜處理后，按S-P 試劑盒步驟進(jìn)行操作，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，干燥封片。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 6 組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。

表1 6 組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表1 6 組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.01；與乳癖消片組比較，4） P＜0.05，5） P＜0.01。

組別正常對(duì)照組模 型 組乳癖消片組低劑量組中劑量組高劑量組n 8 8 8 8 8 8紅細(xì)胞壓積／（v／v）0.388±0.03 0.486±0.051）0.427±0.032）3）4）0.477±0.031）5）0.437±0.032）3）5）0.406±0.032）3）4）血漿黏度／（mPa·S）1.006±0.27 2.282±0.421）1.141±0.432）3）2.172±0.401）5）1.340±0.332）3）5）1.070±0.522）3）4）全血高切還原黏度／（mPa·S）9.546±2.61 16.050±3.191）11.632±2.612）3）15.785±2.661）5）12.804±1.202）3）5）11.372±2.362）3）4）全血低切還原黏度／（mPa·S）25.483±4.87 34.512±3.801）28.883±4.872）3）33.655±3.681）5）30.764±2.1632）3）5）28.560±2.562）3）4）全血高切黏度／（mPa·S）4.665±0.69 7.644±0.581）5.965±0.692）3）7.534±0.551）5）6.576±0.642）5）5.358±0.962）3）4）全血低切黏度／（mPa·S）10.004±1.72 16.306±0.921）13.804±1.722）3）15.996±0.961）5）13.861±0.862）5）13.001±1.352）3）4）

3.2 6 組大鼠PCNA 蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)圖1、表2。

圖1 6 組大鼠PCNA 染色圖（×200）

4 討 論

乳腺增生病的發(fā)生是一個(gè)慢性長(zhǎng)期的過(guò)程，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為各種長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的慢性病癥，必定是由淺入深進(jìn)展，逐漸影響體內(nèi)的血液循行，最終導(dǎo)致瘀血的發(fā)生。清代葉天士說(shuō)“初病在氣，久病在血”，這是對(duì)久病從瘀的最好闡釋。 瘀水同源，互為因果。血瘀會(huì)影響津液的代謝，具體轉(zhuǎn)化過(guò)程是：血瘀則氣滯，氣滯則津停，氣不布津，終致水飲的形成。 正如唐容川所說(shuō)：“瘀血化水，亦發(fā)水腫，是血瘀而兼水也。”現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也認(rèn)為，水腫的發(fā)生，如腎性水腫，從病理上分析發(fā)現(xiàn)其與血液循環(huán)障礙密切關(guān)聯(lián)［2］。人體內(nèi)血液成分的變化，特別是流動(dòng)狀態(tài)的改變，最終可影響水液代謝，出現(xiàn)水腫病。 因而，在治療血瘀證時(shí)，可以加入利水除濕、化痰散結(jié)之品，可有利于瘀血的祛除。 我們認(rèn)為乳腺增生病發(fā)病關(guān)鍵與痰、瘀關(guān)系密切，其臨床表現(xiàn)出的疼痛、腫塊也符合瘀血痰阻的基本病機(jī)特點(diǎn)。

表2 6 組大鼠PCNA 蛋白表達(dá)率比較（x±s）

乳消Ⅲ加味方是以桃紅四物湯為主，加上疏肝理氣、軟堅(jiān)散結(jié)和補(bǔ)腎養(yǎng)陰藥而成。 其中桃紅四物湯可養(yǎng)血活血化瘀，牡蠣、浙貝母可化痰軟堅(jiān)以散結(jié)塊，柴胡、香附等可疏肝理氣、調(diào)經(jīng)止痛，元胡、川楝等可活血行氣止痛，淫羊藿可補(bǔ)腎益精。 從現(xiàn)代藥理研究表明：淫羊藿可提高免疫功能，具有抗腫瘤的功效，其中部分研究還表明淫羊藿能有效殺死乳腺癌細(xì)胞［3－4］。

從實(shí)驗(yàn)過(guò)程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：造模后從第2 周開(kāi)始，各模型組動(dòng)物均出現(xiàn)了雌孕激素增高所帶來(lái)的變化，如體質(zhì)量減輕、豎毛、脫毛、皮毛欠光澤、狀態(tài)低迷、反應(yīng)遲鈍、易激惹、急躁等癥狀，并持續(xù)加重。 從藥物治療開(kāi)始到結(jié)束，各治療組中大鼠的外在表現(xiàn)均出現(xiàn)不同程度的變化，如皮毛逐漸有光澤、體質(zhì)量漸進(jìn)增加、倦怠疲乏、易激惹的狀態(tài)等均有不同程度的改善，尤以乳消Ⅲ加味高劑量組為明顯，其大鼠皮毛光澤，易激惹狀態(tài)趨于消失，進(jìn)食量增加，脫毛等癥狀基本消失。 乳消Ⅲ加味高劑量組治療效果優(yōu)于乳消Ⅲ加味中、低劑量組和乳癖消片組。以上現(xiàn)象說(shuō)明在外源性雌孕激素誘導(dǎo)下動(dòng)物乳腺組織出現(xiàn)了增生，原因是擾亂了動(dòng)物體內(nèi)性激素代謝，對(duì)模型動(dòng)物的整體生存狀態(tài)產(chǎn)生了影響。 乳消Ⅲ加味高劑量組在改善上述一系列癥狀時(shí)效果較好，從而也間接說(shuō)明了乳消Ⅲ加味高劑量組有著較顯著的糾正性激素水平失調(diào)的作用。

本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的血液流變學(xué)指標(biāo)結(jié)果顯示，乳腺增生模型大鼠血液流變血出現(xiàn)了高黏、高凝、高聚狀態(tài)，各治療組針對(duì)乳腺增生病模型大鼠血液流變學(xué)的狀況均有不同程度的改善，其中乳消Ⅲ加味高劑量組能最有效改善血液高黏、高凝、高聚的狀態(tài)，結(jié)果與空白對(duì)照組相近，說(shuō)明乳腺增生病存在“瘀阻”的病理改變，為中藥采用活血化瘀治療該病提供了理論依據(jù)。 同時(shí)我們推測(cè)，乳消Ⅲ加味方通過(guò)化瘀散結(jié)、理氣養(yǎng)血的作用，去除體內(nèi)痰瘀之濁，從而改變了機(jī)體的血液流變血狀態(tài)，促進(jìn)乳腺組織局部微循環(huán)情況，其作用與用藥濃度有一定相關(guān)性。

PCNA 是 細(xì) 胞 增 殖 狀 態(tài) 的 理 想 標(biāo) 記 物［5］，在 各種惡性腫瘤中均有過(guò)度表達(dá)，且其表達(dá)隨著正常組織惡變程度加重而增高。 相關(guān)報(bào)道表明，在乳腺組織中PCNA 存在著陽(yáng)性表達(dá)，并且隨著增生程度的加重，其陽(yáng)性表達(dá)率增加。 本實(shí)驗(yàn)研究顯示，乳腺增生大鼠模型中存在著PCNA 的陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率隨著增生程度的加重而表達(dá)增強(qiáng)。 經(jīng)藥物治療后，各治療組均有不同程度改善乳腺增生模型大鼠PCNA 的陽(yáng)性表達(dá)率，其中乳消Ⅲ加味高劑量組效果最為顯著。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，PCNA 陽(yáng)性表達(dá)與血液流變學(xué)之間有一定的相關(guān)性，乳腺增生模型大鼠乳腺上皮組織中PCNA 陽(yáng)性表達(dá)率高同時(shí)其體內(nèi)血液流變學(xué)高凝狀態(tài)越顯著。

綜上，乳消Ⅲ加味方在改善乳腺增生模型大鼠血液高黏、高凝、高聚的狀態(tài)方面效果較為顯著，且能降低乳腺上皮組織PCNA 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率，這說(shuō)明本方的創(chuàng)制切合乳腺增生病的病機(jī)關(guān)鍵。 其作用機(jī)理可能是通過(guò)調(diào)理肝腎、化瘀散結(jié)，改變了模型動(dòng)物血液流變學(xué)高凝狀態(tài)，降低了乳腺上皮組織PCNA 陽(yáng)性表達(dá)，從而改善乳房組織局部微循環(huán)進(jìn)而緩解模型大鼠乳腺增生的狀態(tài)，達(dá)到治療乳腺增生的作用。