蓯蓉舒痙顆粒中間體總多糖的質(zhì)量控制研究

洪麗婷，劉秀棉，陳 丹*，黃慶德，蔡 晶，余文靜，熊朝棟

（1. 福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州350122；2. 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，福建 福州350122）

蓯蓉舒痙顆粒由蓯蓉、黃精等中藥組成，是在中醫(yī)藥理論指導下，結(jié)合現(xiàn)代最新研究成果，針對帕金森病肌強直開發(fā)研制的顆粒劑［1］。 研究表明，蓯蓉舒痙顆粒的多糖組分是抗帕金森病肌強直作用的重要藥效部位［2-3］。 多糖作為生命的有機體，與維持生命的種種生理機能有著密切的聯(lián)系，它一般是由10 個以上醛糖和（或）酮糖通過糖苷鍵連接在一起的聚合物。 為確保蓯蓉舒痙顆粒成品質(zhì)量，需要在生產(chǎn)過程中建立有效控制顆粒劑中間體總多糖含量的測定方法。 故本實驗以葡萄糖為對照品，蒽酮-硫酸溶液為顯色劑，在582 nm 波長處測定蓯蓉舒痙顆粒中間體總多糖含量，并對三批蓯蓉舒痙顆粒中間體樣本進行含量檢測。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 XS 205 十萬分之一電子天平、AR 2140萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；HH-S 型水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-4802 型雙光束紫外可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）。

1.2 試藥 蓯蓉舒痙顆粒中間體（自制，批號20190403，20190405，20190407）；D-無水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201707）；蒽酮（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180111）；硫酸、無水乙醇等其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為0.34 mg／mL 的對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備 取蓯蓉舒痙顆粒中間體粉末約0.25 g，精密稱定，置于50 mL 離心管中，加入5 mL 水，超聲15 min 使溶解，加入20 mL 無水乙醇，快攪慢加，置4 ℃冰箱中靜置12 h，以4 000 r／min離心15 min，棄上清液，殘渣用80%乙醇洗滌2 次，每次2 mL，殘渣烘干，加水適量使溶解，定量轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 蒽酮-硫酸溶液配制 稱取0.20 g 蒽酮，用濃硫酸溶解并制得0.2%蒽酮-硫酸溶液，注意避光保存，臨用新配。

2.4 測定波長的選擇 精密吸取對照品溶液0.4 mL、供試品溶液1.0 mL 及蒸餾水（即空白對照溶液）1.0 mL，分別置10 mL 潔凈干燥的具塞刻度試管中，加水補至2 mL，振蕩搖勻，在冰水浴中緩緩滴加新鮮配制的0.2%蒽酮-硫酸溶液8 mL，混勻，放冷后置沸水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出。 分別在500～800 nm 波長范圍進行掃描，確定最大吸收波長。 實驗結(jié)果表明，葡萄糖對照品溶液和供試品溶液在582 nm 波長處均有最大吸收，空白溶液無干擾，故選定582 nm 為測定顆粒劑中間體總多糖的測定波長，見圖1。

2.5 標準曲線制備及線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8 mL，分別置于10 mL 潔凈干燥的具塞刻度試管中，按“2.4”項下自“加水補至2 mL……”起，同法操作，在582 nm 波長處測定吸光度值A，以吸光度值（A）為縱坐標，無水葡萄糖質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，線性回歸并繪制標準曲線。 實驗結(jié)果表明，回歸方程A＝3.727×102C＋4.465×102，r＝0.998 8。 無水葡萄糖質(zhì)量濃度在3.41～27.26 μg／mL 范圍內(nèi)與吸光度A 呈良好的線性關(guān)系。 結(jié)果見表1、圖2。

圖1 顯色后吸收光譜圖

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

圖2 葡萄糖標準曲線圖

2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液0.5 mL，置10 mL 具塞干燥試管中，按“2.4”項下自“加水補至2 mL……”起，同法操作，在582 nm 波長處連續(xù)測定吸光度值6 次。 實驗結(jié)果表明，吸光度分別為0.675 6、0.675 6、0.675 5、0.675 5、0.675 5、0.675 4，RSD 值為0.01%，儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按“2.4”項下自“加水補至2 mL……”起，同法操作，在室溫下避光放置，分別在0、30、60、90、120、150、180 min 時，在582 nm 波長處測定吸光度A。 實驗結(jié)果表明，吸光度分別為0.448 0、0.446 4、0.441 4、0.441 6、0.437 7、0.437 6、0.437 8，RSD 值為0.96%，供試品溶液顯色后在室溫避光放置3 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗 分別精密稱取蓯蓉舒痙顆粒中間體粉末（批號20190405）約0.25 g，6 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下自“加水補至2 mL……”起，同法操作，在582 nm 波長處測定吸光度，計算總多糖含量。 實驗結(jié)果表明，總多糖平均含量為21.85 mg／g，RSD 值為1.00%，該方法重復性良好。 見表2。

表2 重復性試驗考察結(jié)果

2.9 加樣回收率試驗 分別精密稱取已知總多糖含量（21.85 mg／g）的蓯蓉舒痙顆粒中間體粉末（批號20190405）約0.125 g，6 份，按“2.2”項下方法處理樣品，并分別精密加入濃度為2.36 mg／mL 的無水葡萄糖對照品溶液1.0 mL，繼續(xù)加水至刻度線，搖勻，即得回收率測定的供試品溶液，按照“2.4”項下自“加水補至2 mL……”起，同法操作，于582 nm處測定吸光度并計算總多糖含量，計算回收率。 實驗結(jié)果測得的平均回收率為98.32%，RSD 值為1.65%。 實驗結(jié)果表明，方法準確度較高。 見表3。

2.10 樣品含量測定 取三批蓯蓉舒痙顆粒中間體，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下自“加水補至2 mL……”起，同法操作，在582 nm波長處測定吸光度，計算總多糖含量，每批次平行試驗3 次。 見表4。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

表4 樣品總多糖含量測定結(jié)果（n＝3）

3 討 論

現(xiàn)在普遍采用的多糖含量測定方法，是利用多糖在強酸性條件下水解生成單糖，繼續(xù)脫水成糠醛或者糠醛類衍生物，然后再與酚類或胺類化合物縮合， 生成有特殊顏色物質(zhì)后用分光光度法測定，其顯色深度與多糖的含量呈線性關(guān)系，這類方法有蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法和地衣酚-硫酸法。預實驗曾比較以常用的蒽酮-硫酸法及苯酚-硫酸法測定蓯蓉舒痙顆粒中間體總多糖含量，由于苯酚易氧化，苯酚用前最好需重蒸，操作較繁瑣，且采用苯酚-硫酸法測定時含量結(jié)果數(shù)據(jù)變化較大，穩(wěn)定性稍差。因此，實驗選用《中國藥典》2015 年版黃精“含量測定”項下所采用的蒽酮-硫酸法作為蓯蓉舒痙顆粒中間體的總多糖含量測定方法［4］，經(jīng)方法學考察結(jié)果穩(wěn)定、準確且重復性良好。 實驗過程，蒽酮-硫酸溶液宜新鮮配制，避光保存；待測液需放置時應避光、干燥放置，避免蒽酮-硫酸試劑吸水、分解，導致結(jié)果波動。 試驗應平行操作，避免環(huán)境、試劑批次對測定結(jié)果的影響。

課題組制備的蓯蓉舒痙顆粒是由黃精等中藥組成，據(jù)文獻［5］報道，黃精多糖的單糖組成主要含有葡萄糖、果糖、半乳糖等，且《中國藥典》2015 年版的中藥黃精多糖含量測定方法以無水葡萄糖為對照品［4］，故蓯蓉舒痙顆粒中間體總多糖含量測定選擇以葡萄糖為對照。

蓯蓉舒痙顆粒劑的輔料之一為糊精，預實驗結(jié)果表明，隨著糊精比例的增加，顆粒劑總多糖含量增加，可能是糊精在測定條件下被水解成單糖，干擾蓯蓉舒痙顆粒劑的多糖含量測定，引起誤差［6-7］。 因此，在蓯蓉舒痙顆粒制備工藝研究過程對其中間體進行總多糖的含量測定，在關(guān)鍵環(huán)節(jié)控制蓯蓉舒痙顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定，確保最終成品質(zhì)量，為蓯蓉舒痙顆?？偠嗵琴|(zhì)量控制方法的建立提供實驗依據(jù)。