阿那白滯素在治療大鼠前節(jié)內(nèi)眼模擬手術(shù)誘發(fā)的血-視網(wǎng)膜屏障破壞中的作用△

鄭永征 謝茂松 劉光輝 潘銘東

囊樣黃斑水腫(cystoid macular edema，CME)可發(fā)生于各種內(nèi)眼手術(shù)后，如白內(nèi)障手術(shù)[1-3]、小梁切除術(shù)[4]和角膜移植手術(shù)[5]。術(shù)后CME是由血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)破壞引起的[6]。目前，術(shù)后CME的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，多數(shù)研究者認(rèn)為炎癥是其發(fā)病的主要原因[7-9]。炎癥假說推測(cè)炎癥因子可在房水中積聚并破壞血-房水屏障(BAB)。炎癥因子可直接擴(kuò)散到玻璃體內(nèi)并破壞BRB，導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫[3，7-8]。

由于缺乏理想的動(dòng)物模型，術(shù)后CME的發(fā)病機(jī)制研究十分困難[7]。我們前期建立了一種實(shí)用的前節(jié)內(nèi)眼模擬手術(shù)誘發(fā)BRB破壞的大鼠模型[10]，發(fā)現(xiàn)前列腺素在BRB破壞的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，前列腺素拮抗劑可以減輕大鼠模型中的BRB破壞作用。非甾體消炎藥預(yù)防性治療可以達(dá)到更好的療效[11]。然而，前列腺素拮抗劑只能減輕BRB破壞，但不能完全阻止BRB的破壞作用，這表明除了前列腺素外，還可能存在其他炎癥因子。

白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)是一種重要的促炎細(xì)胞因子。IL-1β在創(chuàng)傷或感染的炎癥和免疫反應(yīng)中起重要作用[12-13]。在多種眼部手術(shù)后或疾病中IL-1β表達(dá)增加，如白內(nèi)障手術(shù)[14-15]、葡萄膜炎和視網(wǎng)膜血管炎[16]、年齡相關(guān)性黃斑變性、息肉狀脈絡(luò)膜血管病變[17]、增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變[18]等。阿那白滯素是白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)受體的重組競爭性拮抗劑，具有抗炎作用[19-20]。本研究旨在探討阿那白滯素在眼前節(jié)內(nèi)眼模擬手術(shù)誘發(fā)的BRB破壞中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料采用健康雄性SD大鼠(中國上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，體質(zhì)量(300±20)g，8周齡。本研究嚴(yán)格按照國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南中的建議進(jìn)行。鹽酸氯胺酮/鹽酸二甲苯嗪溶液(K4138，Sigma Aldrich，美國)1 mL·kg-1體質(zhì)量全身麻醉，局部麻醉使用奧布卡因滴眼液(Benoxil?，Santen，日本)。

1.2 前節(jié)內(nèi)眼模擬手術(shù)誘發(fā)BRB破壞大鼠模型制作前節(jié)內(nèi)眼模擬手術(shù)誘發(fā)BRB破壞大鼠模型制作已在前期研究中報(bào)道過[10]。在手術(shù)顯微鏡下，將彎曲的尖頭27G針頭從角膜緣穿刺進(jìn)入前房后退出，避免觸及虹膜、晶狀體和角膜內(nèi)皮。另一根彎曲的鈍頭27G針頭經(jīng)穿刺口插入前房，針頭末端通過輸液管連接到平衡鹽溶液?？刂破胶恹}溶液的壓力為 0～12 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg，大鼠生理性眼壓范圍)，振蕩30次，退出針頭，前房成形。將眼球垂直暴露在顯微鏡光源下照射60 min(8000 Lux)。光照期間，角膜用平衡鹽溶液持續(xù)濕潤，每分鐘20滴，對(duì)側(cè)眼用膠帶封住眼瞼。造模后使用氧氟沙星滴眼液(Tarivid?，Santen，日本)滴眼，每天3次。

1.3 各組大鼠房水和玻璃體內(nèi)的IL-1β濃度檢測(cè)將144只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、局部治療組和全身治療組，每組各36只。對(duì)照組、模型組使用Hamilton顯微注射器將5 μL生理鹽水注入前房。局部治療組建模后使用Hamilton顯微注射器將5 μL阿那白滯素(150 g·L-1，Amgen Inc，Thousand Oaks，加拿大)注入前房[21]。對(duì)照組、模型組、局部治療組每天皮下注射40 μL生理鹽水，連續(xù)3 d。全身治療組建模后使用Hamilton顯微注射器將5 μL生理鹽水注入前房，每天皮下注射20 mg·kg-1阿那白滯素40 μL[22]，連續(xù)3 d。分別于造模后4 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d，摘除大鼠眼球，-20 ℃冷凍2 h。然后沿角鞏膜緣切開眼球。將冷凍的房水和玻璃體分離并儲(chǔ)存在EP管中。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)房水和玻璃體內(nèi)IL-1β的濃度[大鼠IL-1β ELISA試劑盒(Cat.No.：RLB00，R&D Inc.)]。

1.4 阿那白滯素對(duì)大鼠模型BRB破壞的影響分別于造模后4 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d，使用Evans藍(lán)色作為示蹤劑定量測(cè)量BRB的完整性。

使用Evans藍(lán)作為示蹤劑定量測(cè)量BRB的完整性已有報(bào)道[10，23]。鼠尾靜脈注射Evans藍(lán)(45 mg·kg-1，206334，Sigma-Aldrich，美國)。2 h后經(jīng)股動(dòng)脈抽血，離心取上清檢測(cè)血漿中Evans藍(lán)濃度，經(jīng)左心室灌注10 g·L-1多聚甲醛檸檬酸鹽緩沖液(37 ℃，pH 3.5)，灌注壓為120 mmHg(大鼠生理性血壓)，灌注2 min。灌注后摘除眼球速凍；沿赤道部切開眼球，在顯微鏡下分離視網(wǎng)膜，放入預(yù)先稱質(zhì)量的EP管內(nèi)，真空干燥(5 h，60 ℃)后稱質(zhì)量；每管加入120 μL甲酰胺(F5786，Sigma-Aldrich，美國)，萃取視網(wǎng)膜中的Evans藍(lán)；萃取液離心(15 000 r·min-1，30 min)后取上清液100 μL，采用雙波[Evans藍(lán)吸收峰620 nm，吸收谷740 nm，吸光度(A)值=A620 nm-A740 nm]檢測(cè)Evans藍(lán)濃度(紫外-可見光分光光度計(jì)，Model Du-640，Beckman，F(xiàn)ulletton，加拿大)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中Evans藍(lán)濃度，Evans藍(lán)滲漏量計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[23]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件21.0分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用配對(duì)t檢驗(yàn)或ANOVA分析數(shù)據(jù)，LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠房水和玻璃體內(nèi)IL-1β濃度造模后1 d、2 d、3 d、5 d，四組間房水和玻璃體內(nèi)IL-1β濃度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(房水：F1 d=382.05，F(xiàn)2 d=1651.89，F(xiàn)3 d=266.66，F(xiàn)5 d=120.62；均為P<0.001。玻璃體：F1 d=514.61，F(xiàn)2 d=1055.34，F(xiàn)3 d=560.76，F(xiàn)5 d=49.63；均為P<0.001)。其他時(shí)間點(diǎn)四組間房水和玻璃體內(nèi)IL-1β濃度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。與對(duì)照組相比，模型組、局部治療組和全身治療組房水和玻璃體內(nèi)IL-1β濃度在造模后4 h均略有增加(均為P>0.05)，造模后1 d均顯著增加(均為P<0.05)，造模后2 d時(shí)均達(dá)到峰值(均為P<0.05)，造模后3 d、5 d均下降(均為P<0.05)，造模后7 d接近對(duì)照組水平(均為P>0.05)。局部治療組和全身治療組房水和玻璃體內(nèi)IL-1β濃度在造模后1 d、2 d、3 d、5 d均低于模型組(均為P<0.05)，造模后4 h、7 d與對(duì)照組、模型組接近(均為P>0.05)。局部治療組房水和玻璃體內(nèi)IL-1β濃度在造模后1 d、2 d均低于全身治療組，但造模后3 d時(shí)高于全身治療組(均為P<0.001)。造模后4 h、5 d、7 d與全身治療組接近(均為P>0.05)。見圖1。

圖1 大鼠模型房水和玻璃體內(nèi)IL-1β濃度(n=6)。A：房水；B：玻璃體。與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.2 阿那白滯素對(duì)大鼠模型BRB破壞的影響造模后1 d、2 d、3 d、5 d，四組間視網(wǎng)膜Evans藍(lán)滲漏量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1 d=76.23，F(xiàn)2 d=364.03，F(xiàn)3 d=399.02，F(xiàn)5 d=28.67；均為P<0.001)，見圖2。其他時(shí)間點(diǎn)四組間視網(wǎng)膜Evans藍(lán)滲漏量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。視網(wǎng)膜Evans藍(lán)滲漏量在造模后1 d局部治療組低于全身治療組，但造模后2 d、3 d局部治療組均高于全身治療組(均為P<0.05)。局部治療組和全身治療組視網(wǎng)膜Evans藍(lán)滲漏量在造模后1 d、2 d、3 d、5 d均低于模型組，但均高于對(duì)照組(均為P<0.05)。造模后4 h、7 d與對(duì)照組、模型組接近(均為P>0.05)。

圖2 大鼠模型中視網(wǎng)膜Evans藍(lán)滲漏量(n=6)。*P<0.05

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，前節(jié)內(nèi)眼模擬手術(shù)模型大鼠房水中的IL-1β濃度在造模后4 h較對(duì)照組僅略微增加，并在造模后2 d時(shí)達(dá)到峰值。IL-1β是一種重要的炎癥前細(xì)胞因子，在免疫炎癥的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。IL-1β主要由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等分泌[12-13]。白內(nèi)障常規(guī)超聲乳化手術(shù)后，患者房水中IL-1β和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)均增加[14-15]。MCP-1可以募集單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等，說明手術(shù)可以刺激IL-1β的表達(dá)。而IL-1β可以破壞BAB并擴(kuò)散到玻璃體內(nèi)。IL-1β具有強(qiáng)烈的促炎作用。IL-1β可以與IL-1受體結(jié)合，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致許多轉(zhuǎn)錄因子的活化，如JNK、JAK/STAT、NF-κB、RhoA和MAPK。IL-1β和受體結(jié)合具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如促進(jìn)免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)、參與炎癥反應(yīng)等。IL-1β在炎癥早期顯著增加，它參與T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活化，并誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集到炎癥部位，刺激其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)[24-27]。IL-1β可作用于視網(wǎng)膜血管和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，引起視網(wǎng)膜內(nèi)屏障和視網(wǎng)膜外屏障的滲透性增加，導(dǎo)致視網(wǎng)膜Evans藍(lán)滲漏增加。

本研究發(fā)現(xiàn)局部治療組和全身治療組的房水和玻璃體內(nèi)IL-1β濃度、視網(wǎng)膜Evans藍(lán)滲漏量均低于模型組，但高于對(duì)照組。這表明局部或全身阿那白滯素給藥可以降低房水和玻璃體內(nèi)IL-1β濃度，減輕炎癥反應(yīng)，減輕BRB破壞的效果。阻斷IL-1(尤其是IL-1β)的活性是自身免疫性疾病的標(biāo)準(zhǔn)治療。阿那白滯素(IL-1Ra)是FDA批準(zhǔn)的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物[19-20]。阿那白滯素還用于治療其他炎癥性疾病，如葡萄膜炎[28]、心包炎和心包填塞[29]、脈絡(luò)膜新生血管膜[21]。阿那白滯素是IL-1受體的天然競爭性拮抗劑，通過競爭性結(jié)合，起到IL-1α和IL-1β抑制劑的作用，可以與IL-1受體結(jié)合，但不會(huì)激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[19-20]。因此，阿那白滯素可以預(yù)防由IL-1β誘導(dǎo)的炎癥，減輕BAB和BRB屏障的破壞。

本研究發(fā)現(xiàn)局部治療組的視網(wǎng)膜Evans藍(lán)滲漏量在造模后1 d低于全身治療組，但在造模后2 d和3 d高于全身治療組，其原因可能是阿那白滯素的半衰期很短。全身治療組每天皮下注射阿那白滯素，而局部治療組僅接受一次阿那白滯素注射。如果阿那白滯素可以制成滴眼液并且每天滴用，療效可能更好。

本研究中，我們證明了大鼠模型的房水和玻璃體內(nèi)IL-1β的濃度增加。阿那白滯素可以減少大鼠模型中視網(wǎng)膜Evans藍(lán)的滲漏。這表明IL-1β在前節(jié)內(nèi)眼模擬手術(shù)誘導(dǎo)的BRB破壞中起重要作用，阿那白滯素可以減輕BRB的破壞。