鮮姜汁對(duì)不同酵母菌抑制作用的研究

楊雷鵬

（山西師范大學(xué)，山西臨汾 041000）

生姜，作為一種常見(jiàn)的香辛料，含有多種生物活性成分，如姜醇、姜酚、姜辣素等，具有抗氧化、抑菌、驅(qū)寒等功效，是藥食兩用作物[1]。醫(yī)學(xué)研究方面，已經(jīng)證明生姜對(duì)細(xì)菌有明顯的抑制作用，還兼有軟化血管、降血脂的功效，可用于治療哮喘、腸道潰瘍、心血管疾病等[2-3]。作為天然的抗氧化劑，生姜對(duì)于食品工業(yè)和人體健康有重要意義[4]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于生姜抑菌作用的研究主要集中在細(xì)菌方面，而對(duì)于生姜，特別是鮮姜汁對(duì)于酵母菌抑菌作用的研究則較少[5-6]。酵母是傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)良菌種，主要用于酒類釀造。酵母可利用不同的原料，在不同的發(fā)酵條件下產(chǎn)生各種產(chǎn)物，如脂肪酶、麥角固醇、谷胱甘肽、γ-氨基丁酸等，在食藥等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[7-9]。研究鮮姜汁對(duì)酵母菌的抑制作用，可為生姜高附加值產(chǎn)品（如生姜酒）的研發(fā)提供理論依據(jù)。國(guó)內(nèi)外對(duì)于微生物抑菌作用的研究普遍采用的是牛津杯法測(cè)量抑菌圈直徑，對(duì)微生物的抑菌作用進(jìn)行觀察[10]。與傳統(tǒng)采用的濾紙片法相比，牛津杯法得到的數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確和客觀[11]，但這種方法在實(shí)際操作中會(huì)因?yàn)楦鞣N試驗(yàn)因素如抑制劑顆粒大小與滲透性等問(wèn)題的存在而容易出現(xiàn)較大實(shí)驗(yàn)誤差[12]。因此，僅靠單一的實(shí)驗(yàn)方法，確定鮮姜汁對(duì)酵母菌抑制作用的強(qiáng)弱存在一定的局限性。本研究以5 種常見(jiàn)酵母菌為材料，利用牛津杯法測(cè)定抑菌圈直徑，并與DPPH、ABTS、FRAP 等常用抗氧化活性測(cè)定方法聯(lián)用，來(lái)綜合考察鮮姜汁對(duì)于酵母菌的抑菌作用，為鮮姜汁的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)硫生姜：鮮品，購(gòu)置于臨汾堯都區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

供試菌種：試驗(yàn)所用5 種酵母菌W.anomalus J7-2、W.anomalus J11-2、W.anomalus J12-7、W.anomalus J15-2、W.anomalus J15-15，均為山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

試驗(yàn)試劑：無(wú)水葡萄糖、麥芽粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；DPPH、ABTS、TPTZ、水溶性維生素E（TE），北京伊諾凱科技有限公司；甲醇、冰乙酸、結(jié)晶乙酸鈉、濃鹽酸、過(guò)硫酸鉀、氯化鈉、水合氯化鐵，天津科密歐化學(xué)試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA22O4B 型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HPX-9272 MBE 型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHA-C 型水浴恒溫振蕩器，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5804R 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)基因有限公司；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司，PH-3C 型pH 計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；752N 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鮮姜汁的制備

將鮮姜洗凈晾干后，放入超凈工作臺(tái)中，用研缽研磨成汁，過(guò)濾后得到姜汁原液，再按照料液比鮮姜汁:水=1:1、1:2、1:4、1:8、1:16（g:mL）的比例對(duì)姜汁原液進(jìn)行梯度稀釋，得到5 個(gè)不同濃度梯度的鮮姜汁。

1.3.2 培養(yǎng)基制備

量取10 °Bx 的麥芽汁1 000 mL，加入15 g 瓊脂，混合均勻后加熱至瓊脂完全溶解，調(diào)節(jié)pH 為6.0，趁熱分裝于250 mL 錐形瓶中，并制備試管斜面，滅菌。

1.3.3 菌種活化

將上述5 種酵母菌分別接入試管斜面，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，取出備用。

1.3.4 菌懸液制備

用接種環(huán)從試管斜面中挑取一定量活化后的酵母菌，放入裝有10 mL 無(wú)菌水的試管中，放入恒溫振蕩器中振蕩約10 min，使菌體散開(kāi)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 抑菌圈直徑的測(cè)定

參考孟君等[13]的試驗(yàn)方法。取直徑6 mm 的牛津杯，滅菌后備用。用移液槍吸取1 mL 菌懸液于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，用涂布器涂布均勻；用無(wú)菌鑷子夾取牛津杯緊貼在含酵母菌的培養(yǎng)基上，用移液槍吸取200 μL 鮮姜汁，每個(gè)平板上放置4 個(gè)同一種濃度梯度鮮姜汁的牛津杯，每個(gè)濃度重復(fù)3 次，取平均值作為最終結(jié)果；向牛津杯中移入200 μL 無(wú)菌水代替鮮姜汁作為空白對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出后測(cè)定抑菌圈直徑，比較不同濃度鮮姜汁對(duì)于不同種類酵母的抑菌效果。

1.4.2 抗氧化活性的測(cè)定

參考范祺、郭京波等[14,15]的試驗(yàn)方法。在麥芽汁液體培養(yǎng)基中接入1%上述5 種酵母菌菌懸液，并添加200 μL不同料液比的鮮姜汁為底物，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)液全部移入離心管，用5 mL 蒸餾水洗滌三角瓶，洗滌液一同移入離心管，混合均勻后8 000 r/min離心15 min。離心完成后，吸取上清液，用蒸餾水定容到10 mL，分別進(jìn)行DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、與Fe3+還原能力的測(cè)定，以三者相加后得到的總和，作為該酵母菌的總抗氧化活性。以未接種酵母菌的鮮姜汁作為空白對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。每次試驗(yàn)均設(shè)置三個(gè)平行，以平行實(shí)驗(yàn)誤差不超過(guò)5%為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行結(jié)果與數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛津杯抑菌試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定不同平板上5 種酵母菌W.anomalus J7-2、W.anomalus J11-2、W.anomalus J12-7、W.anomalus J15-2、W.anomalus J15-15 抑菌圈直徑（單位：cm），確定不同濃度鮮姜汁對(duì)酵母菌的抑制作用，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

如圖1 所示，隨著生姜料液比的逐漸減小，各個(gè)酵母抑菌圈的直徑均開(kāi)始逐漸變小。從圖中可以看到，鮮姜汁對(duì)于不同酵母的抑制作用各不相同：W.anomalus J12-7 所對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑較其他4 種酵母而言最小，表明鮮姜汁對(duì)該菌種的抑制作用最弱；同理，W.anomalus J15-2 所對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑較其他4 種酵母而言最大，表明鮮姜汁對(duì)該菌種的抑制作用最強(qiáng)；因此選擇受鮮姜汁抑制程度最小的酵母菌W.anomalus J12-7 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。此外，就鮮姜汁料液比方面而言，當(dāng)料液比為1:1時(shí)，對(duì)于各個(gè)酵母的抑制作用均相對(duì)較強(qiáng)；在料液比為1:1至1:8 之間時(shí)，曲線斜率較大，抑菌圈直徑快速縮??；在料液比為1:8 至1:16 之間，曲線斜率較小，表明這一區(qū)間鮮姜汁對(duì)于酵母菌抑制作用較小，酵母菌得以持續(xù)生長(zhǎng)繁殖，因此，考慮選用生姜料液比為1:8 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 抗氧化能力評(píng)價(jià)

試驗(yàn)以200 μL 料液比為1:8 的鮮姜汁為發(fā)酵底物，添加到麥芽汁液體培養(yǎng)基中，經(jīng)上述5 種酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定鮮姜汁在發(fā)酵后的總抗氧化能力（單位：μmol TE/g Ginger juice，以下簡(jiǎn)稱μmol/g），結(jié)果見(jiàn)圖2。

如圖2 所示，經(jīng)5 種酵母發(fā)酵后，鮮姜汁的總抗氧化活性（TAC）之間差異顯著，W.anomalus J7-2 為3 345.09±167.26 μmol/g；W.anomalus J11-2 為3 155.65±157.78 μmol/g；W.anomalus J12-7 為3 632.36±181.62 μmol/g；W.anomalus J15-2 為3 223.15±161.16 μmol/g；W.anomalus J15-15為3 023.84±151.19 μmol/g，而對(duì)照組總抗氧化活性僅為1 805.96±90.30 μmol/g。其中W.anomalus J12-7 的抗氧化活性最高，發(fā)酵力最強(qiáng)，發(fā)酵液氣味較為柔和，姜辣味顯著降低，并伴有淡淡的葡萄酒香味，表明其對(duì)于鮮姜汁轉(zhuǎn)化程度最強(qiáng)。其余4 種酵母菌中，W.anomalus J11-2無(wú)明顯特殊氣味產(chǎn)生，姜辣味較為明顯；W.anomalus J15-2 和W.anomalus J15-15 發(fā)酵產(chǎn)物有明顯的啤酒氣味，且姜辣味較濃；W.anomalus J7-2 產(chǎn)生較為濃烈的白酒味，對(duì)于生姜汁轉(zhuǎn)化程度不如W.anomalus J12-7。

3 結(jié)論

本文通過(guò)研究鮮姜汁對(duì)5 種常見(jiàn)酵母菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)W.anomalus J12-7 無(wú)論是牛津杯抑菌試驗(yàn)，還是抗氧化能力評(píng)價(jià)，相對(duì)其他酵母菌而言，除具備較強(qiáng)耐受性能外，也展現(xiàn)出較高的抗氧化活性，這表明W.anomalus J12-7 在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)于鮮姜汁中部分物質(zhì)進(jìn)行了分解與轉(zhuǎn)化，并生成具有更高生物活性的物質(zhì)，具體的轉(zhuǎn)化物質(zhì)與相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化機(jī)理仍有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。