山荔枝酒精飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

高豐衣，劉啟輝，李敏波，蔡圣寶，易俊潔*

（1.商丘師范學(xué)院生物與食品學(xué)院，河南商丘 476000；2.昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，云南昆明 650500）

山荔枝（Dendrobenthamia japonica var.chinensis）也叫野荔枝，主要分布于中國的云南、四川、西藏等省份，以及印度、巴基斯坦、尼泊爾等地區(qū)[1]。山荔枝具有很高的藥用價值，有通經(jīng)、暖胃、活血等功效[2]，研究表明山荔枝營養(yǎng)成分豐富，含有19 種游離氨基酸，20 種水解氨基酸，VC 含量為24.5 mg/100 g，蛋白質(zhì)占0.49%，總糖占6.25%[3]。另有文獻(xiàn)報道，山荔枝中含有三萜、雙環(huán)烯醚萜苷、環(huán)烯醚萜苷、多酚類、有機(jī)酸類、甾醇、單萜苷、黃酮類、多糖類等多種功能性成分[4-7]。多酚類物質(zhì)是荔枝植物含量豐富的活性成分之一[8-9]，其總酚含量約為101.51～259.18 mg GAE/100 g[10]。李春陽等[11]研究表明，原花青素等酚類物質(zhì)，具有顯著的抗氧化，清除超氧陰離子自由基、羥基自由基，減少脂質(zhì)過氧化自由基等作用。自由基是導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷、致病的重要原子或基團(tuán)，也是參與機(jī)體氧化的重要物質(zhì)[12-13]。蔣本慶等[14]研究發(fā)現(xiàn)水果經(jīng)過發(fā)酵獲得的果酒含有更豐富的抗氧化物質(zhì)，適量飲用可促進(jìn)血液循環(huán)和機(jī)體新陳代謝，對清除體內(nèi)自由基具有積極的作用。

目前，市場上以山荔枝為主要原料的產(chǎn)品較少，尤其是經(jīng)過發(fā)酵的功能性酒精飲料則更少，因此開發(fā)高營養(yǎng)價值、高品質(zhì)的山荔枝發(fā)酵酒精飲料具有重要的意義。但在實際生產(chǎn)過程中，酒精飲料常存在穩(wěn)定性差、澄清度低、易渾濁等問題，嚴(yán)重影響了飲料的品質(zhì)和飲料的產(chǎn)業(yè)發(fā)展?；诖?，本試驗以山荔枝為主要原料進(jìn)行發(fā)酵，通過正交試驗獲得最佳發(fā)酵工藝，并對比分析了四種澄清劑對山荔枝酒精飲料的澄清效果，最后對澄清工藝優(yōu)化后的山荔枝酒精飲料的多酚組成和抗氧化活性進(jìn)行了評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山荔枝購于云南省西雙版納地區(qū)，冷凍備用；釀酒酵母2323，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；甲醇（色譜級）、乙腈（色譜級）、福林酚（分析純），均購于Merck 公司；蔗糖、氫氧化鈉、鹽酸、3,5-二硝基水楊酸、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、無水亞硫酸鈉均為分析純，購于阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra Max M5 型多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices；BSA124S-CW 型電子精密天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Dionex U3000 超高效液相色譜，賽默飛世爾科技（美國）有限公司；Q-Exactive 高分辨軌道離子阱質(zhì)譜，賽默飛世爾科技（德國）有限公司;JN-5200DTS 型超聲，寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司；真空泵，德國Vacuubrand；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；BSA124S-CW 型電子精密天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；BSC-250 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UPHW-I-90T 型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 山荔枝酒精飲料發(fā)酵工藝

冷凍山荔枝→解凍→榨汁→調(diào)整成分（糖度）→接種活化酵母→發(fā)酵→過濾→澄清→陳釀→貯存

1.3.2 操作要點

（1）榨汁

選擇完整、成熟的冷凍山荔枝，解凍后進(jìn)行榨汁。

（2）活化酵母

準(zhǔn)備100 mL、0.05 g/mL 的蔗糖溶液，置于38 ℃水浴中，待溫度恒定，加入10 g 釀酒酵母，恒溫活化30 min，活化過程中會有氣泡產(chǎn)生，每隔10 min 用玻璃棒攪拌一次，至不產(chǎn)生氣泡為止。

（3）接種活化酵母

將酵母活化液的溫度降至發(fā)酵溫度，將山荔枝汁加熱至發(fā)酵溫度，按照試驗要求的量添加酵母活化液。

1.3.3 釀造工藝條件的確定

（1）發(fā)酵溫度對山荔枝酒精飲料品質(zhì)的影響

將發(fā)酵液糖度調(diào)整到180 g/L，向其中添加0.6%的酵母活化液，分別在18、21、24、27 ℃下進(jìn)行發(fā)酵，以感官評定獲得的綜合評分為指標(biāo)，結(jié)合酒精度和還原糖濃度，確定最適發(fā)酵溫度。

（2）蔗糖添加量對山荔枝酒精飲料品質(zhì)的影響

分別將發(fā)酵液的初始糖度調(diào)整到150、180、210、240 g/L，向其中添加0.6%的酵母活化液，在24 ℃下進(jìn)行發(fā)酵，以綜合評分為指標(biāo)，結(jié)合酒精度和還原糖濃度確定最適蔗糖添加量。

（3）酵母添加量對山荔枝酒精飲料品質(zhì)的影響

將發(fā)酵液的初始糖度調(diào)整到180 g/L，分別向發(fā)酵液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的酵母活化液，在24 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，以綜合評分為指標(biāo)，結(jié)合酒精度和還原糖濃度確定最適酵母添加量。

（4）正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9(34)正交試驗。以綜合評分為主要指標(biāo)確定最佳發(fā)酵工藝，正交試驗設(shè)計的因素水平表如表1 所示。

表1 影響發(fā)酵工藝的因素水平表Table 1 Impact factors and level of fermentation process

1.3.4 澄清工藝優(yōu)化

選用4 種澄清劑：果膠酶、硅藻土、殼聚糖、明膠。

澄清方法如下：取10 mL 試管5 只，加入5 mL 自制山荔枝酒精飲料，再加入澄清劑0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，充分混勻并靜置24 h，記錄現(xiàn)象，取其上清液在960 nm 處測其吸光值，并重復(fù)3 次。

1.3.5 理化指標(biāo)的測定

（1）固形物含量

采用臺式阿貝折光儀進(jìn)行測定。

（2）酒精度

采用GB/T 15038 2006 葡萄酒、飲料分析通用方法中的酒精計法進(jìn)行測定[15]。

（3）還原糖含量

發(fā)酵液體中還原糖的測定參考王鵬等[16]、黃進(jìn)[17]的方法，略作修改。發(fā)酵液過濾，取1 mL 濾液定容至50 mL。然后取1 mL 于25 mL 的比色管中，加入DNS 試劑1.5 mL，沸水浴中加熱5 min，冷卻后定容至10 mL，搖勻，540 nm 處測吸光度。

1.3.6 感官評價

發(fā)酵結(jié)束后，由5 名經(jīng)過訓(xùn)練的感官品評員對酒體的色澤、香氣、狀態(tài)等進(jìn)行感官評價，總分100 分。感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評分表Table 2 Sensory assessment criteria

1.3.7 多酚含量測定

樣品前處理：從自制山荔枝酒精飲料樣液中取3 mL樣品，在離心機(jī)中以10 000 r/min 離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μL 微孔濾膜過濾備用。

色譜柱：Thermo Fisher C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）。色譜條件：流動相A-0.1%甲酸水，B-乙腈。梯度洗脫程序如下：0～5 min，5%B；5～10 min，20%B；10～12 min，22%B；12～15 min，25%B；15～20 min，5%B。進(jìn)樣量：2 μL，流速：0.2 mL/min，柱溫：35 ℃。

質(zhì)譜條件：電離模式采用SEI 負(fù)離子檢測模式，碰撞氣體為高純度氦氣（He），霧化氣體為高純度氮氣（N2），鞘氣流速：30 L/min；輔助氣流速：8 L/min；離子源溫度：350 ℃；毛細(xì)管溫度：320 ℃；噴霧電壓：3.2 kV；質(zhì)量掃描范圍m/z：120～1 000。

1.3.8 DPPH·自由基清除能力測定

精確稱取DPPH·粉末0.039 4 g，用甲醇溶解，并定容至100 mL，配制成1 mmol/L DPPH·母液。測定時，用甲醇稀釋10 倍，配制成0.1 mmol/L DPPH·反應(yīng)液。取0.5 mL 稀釋為一定濃度梯度的樣品溶液于離心管中，加入2.0 mL、0.1 mmol/L DPPH·反應(yīng)液混合均勻。將混合反應(yīng)液置于暗處并不斷振蕩30 min，于517 nm 下測定其吸光值?？瞻讓φ战M用水代替樣品溶液，樣品的DPPH·自由基清除能力按式（1）進(jìn)行計算。

式中，A0為對照組吸光值，Ax0為樣品對照組吸光值，Ax為樣品吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗操作均重復(fù)測定3 次，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，所有結(jié)果均利用單因素方差分析（oneway ANOVA）進(jìn)行顯著性分析，采用Tukey 檢測，統(tǒng)計學(xué)分析和作圖均在Origin 8.5 軟件中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵溫度對山荔枝酒精飲料品質(zhì)的影響

表3 發(fā)酵溫度對山荔枝酒精飲料品質(zhì)的影響Table 3 Effect of fermentation temperature on quality of litchi alcohol beverage

發(fā)酵溫度的控制對于發(fā)酵過程尤為重要。溫度對于酵母細(xì)胞的酒精發(fā)酵及蘋果酸分解有很大影響。溫度過高時會使酵母代謝過于旺盛[18]，增殖速度變快，使細(xì)胞逐漸出現(xiàn)衰老，造成提前老化，發(fā)酵停止較早，最終生產(chǎn)的酒精濃度較低，妨礙荔枝酒精飲料色、香、風(fēng)味的形成，還易造成雜菌滋生，不利于發(fā)酵的順利進(jìn)行；溫度較低時，發(fā)酵速度慢，但不易衰老，發(fā)酵持續(xù)時間長，發(fā)酵徹底，最終生產(chǎn)的酒精濃度高。由表3 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，山荔枝酒精飲料的糖度下降，而酒精度呈上升趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度為18 ℃時，其還原糖含量較高。這可能是由于溫度較低不利于酵母繁殖和代謝，沒有足夠的微生物來進(jìn)行發(fā)酵，導(dǎo)致其酒精度低，山荔枝酒精飲料缺少酒香氣，從而影響其綜合評分。當(dāng)發(fā)酵溫度為27 ℃時，其還原糖含量最低，但酒精度并非最高，這可能是由于溫度較高，發(fā)酵速度快，細(xì)胞易衰老，發(fā)酵不徹底，最終產(chǎn)生的酒精濃度較低。根據(jù)綜合評分，最適發(fā)酵溫度選擇24 ℃。

2.1.2 蔗糖添加量對山荔枝酒精飲料品質(zhì)的影響

表4 蔗糖添加量對山荔枝酒精飲料品質(zhì)的影響Table 4 Effect of sucrose content on the quality of litchi alcohol beverage

表4 顯示了蔗糖添加量對山荔枝酒精飲料品質(zhì)的影響。由表可知，隨著蔗糖添加量的提高，山荔枝酒精飲料的酒精度以及還原糖含量也隨之上升。在初始糖度為150 g/L 時，其酒精度太低，酒香氣寡淡[19]，綜合評分最低。初始糖度為210 g/L 時，發(fā)酵比較平穩(wěn)，還原糖含量在80 μg/mL 附近波動，綜合評分最高。初始糖濃度為240 g/L 時，其酒精度最高，但可能由于口感過甜，酒香氣太過濃郁，評分并沒有達(dá)到最高。根據(jù)綜合評分，最適的蔗糖添加量為210 g/L。

2.1.3 酵母添加量對山荔枝酒精飲料品質(zhì)的影響

由表5 可知，酵母添加量對發(fā)酵有一定影響，酵母添加量的高低直接影響山荔枝酒精飲料的色、香和風(fēng)味。當(dāng)酵母添加量為0.4%時，接種量過低，發(fā)酵緩慢且不徹底，導(dǎo)致還原糖濃度和酒精含量較低。當(dāng)酵母添加量為0.6%時，山荔枝酒精飲料發(fā)酵適當(dāng)，酒精度最高。當(dāng)酵母添加量為1%時，還原糖含量高但酒精度增幅較小，這可能是由于酵母增殖速度過快，細(xì)胞過早老化，沒有代謝完全。在整個發(fā)酵過程中，釀酒酵母增殖與還原糖含量和酒精度增加呈一定的比例關(guān)系的[20]。接種量過高時，發(fā)酵速度過快，不利于風(fēng)味形成，且山荔枝原酒的酵母味較重，給后續(xù)的澄清及調(diào)配工藝造成不良影響；接種量過低時，發(fā)酵緩慢，發(fā)酵時間延長，易于雜菌的生長，也會影響山荔枝酒精飲料的風(fēng)味。根據(jù)綜合評分并結(jié)合酒精度和還原糖含量選出酵母最優(yōu)添加量為0.6%。

表5 酵母添加量對山荔枝酒精飲料品質(zhì)的影響Table 5 Effect of yeast addition on quality of litchi alcoholic beverage

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵溫度、初始糖度、酵母接種量為試驗因素，以綜合評分為主要指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗，結(jié)果見表6。

表6 發(fā)酵工藝的正交試驗結(jié)果Table 6 Orthogonal test results of fermentation process

由表6 可知，對山荔枝酒精飲料的品質(zhì)影響主次順序為A＞B＞C，即影響最大的是發(fā)酵溫度，其次是酵母接種量，初始糖度的影響最小。根據(jù)綜合評分可以得出發(fā)酵最佳組合為A3B3C1，即發(fā)酵溫度27 ℃，酵母接種量0.8%，初始糖度180 g/L。對正交試驗結(jié)果進(jìn)行驗證，該工藝加工的山荔枝酒精飲料，所得酒體澄清，色澤均勻一致，典型突出，具有山荔枝獨特的清香味，感官評價綜合評分為89 分，優(yōu)于其他組合。

2.3 澄清工藝優(yōu)化

不同澄清劑對山荔枝酒精飲料的澄清效果如圖1 所示。

2.3.1 殼聚糖對山荔枝酒精飲料的澄清效果

由圖1 可以看出，殼聚糖對山荔枝酒精飲料具有很好的澄清效果，當(dāng)用量在10 g/L 時，澄清效果最好，此時透光率達(dá)到91.40%±0.95%。殼聚糖對山荔枝酒精飲料有較好的絮凝澄清效果，是因為在酸性介質(zhì)中，殼聚糖的游離氨基（NH2）與質(zhì)子H+結(jié)合，成為帶正電荷的高分子物質(zhì)，而飲料中含有大量帶負(fù)電荷的果膠、纖維素、單寧及多聚戊糖等微小顆粒，當(dāng)兩者混合后，依靠靜電作用，飲料中的微小顆粒很快纏繞于有線性分子結(jié)構(gòu)的殼聚糖上，使微小顆粒變成大顆粒，進(jìn)而逐漸沉降，使飲料澄清透明[21]。

2.3.2 果膠酶對山荔枝酒精飲料的澄清效果

圖1 顯示果膠酶的用量在6 g/L 時，山荔枝酒精飲料透光率較高，達(dá)到95.00%±2.23%，這可能是由于果膠酶能水解飲料中果膠等多糖物質(zhì)，使之失去穩(wěn)定性，不溶性大分子物質(zhì)和果肉微粒失去膠體保護(hù)作用而發(fā)生共聚沉淀，因此增加了飲料的透光率[22]。果膠酶用量在6 g/L與8 g/L 時差異不顯著（P＞0.05），增加至10 g/L 時呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為果膠降解所得的低分子物質(zhì)改變了酒中的pH 值，從而影響了果膠酶的澄清效應(yīng)，造成澄清度的降低[23]。

2.3.3 明膠對山荔枝酒精飲料的澄清效果

當(dāng)明膠用量達(dá)到8 g/L 時透光率達(dá)到33.21%±1.17%，此時的澄清效果最好（如圖1 所示）。隨著明膠添加量的增大，山荔枝酒精飲料的透光率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，這可能是由于山荔枝酒精飲料中含有豐富的單寧類物質(zhì)，而明膠屬于蛋白質(zhì)類，可與飲料中的單寧形成蛋白質(zhì)-單寧絡(luò)合物，隨著絡(luò)合物的增多，吸附在酒中的懸浮物將會聚沉，從而達(dá)到澄清效果[24]。當(dāng)明膠用量超過8 g/L 時，由于單寧物質(zhì)不足，過量的明膠形成懸浮物，導(dǎo)致透光率下降。

2.3.4 硅藻土對山荔枝酒精飲料的澄清效果

由圖1 可知，隨著硅藻土添加量的增加，山荔枝酒精飲料的透光率先增加后下降，這是因為硅藻土將酵母沉淀于容器的底部，經(jīng)過一段時間后，酵母繁殖生長，同時進(jìn)行發(fā)酵過程，釋放CO2和酒精，CO2堆積形成氣泡并向上運動，將沉淀攪起，導(dǎo)致澄清度降低和不穩(wěn)定[25]，因此硅藻土溶液的用量超過8 g/L 時，樣品透光率降低。

綜上所述，當(dāng)澄清劑添加量≤8 g/L 時，不同澄清劑對山荔枝酒精飲料澄清效果的整體影響趨勢相似，即隨著添加濃度的升高，澄清效果越顯著。對比四種澄清劑，發(fā)現(xiàn)殼聚糖和果膠酶的澄清效果顯著優(yōu)于明膠和硅藻土（P＜0.05），尤其是果膠酶。在低添加濃度時，果膠酶澄清效果最優(yōu)，但隨著添加濃度增大，殼聚糖和果膠酶之間的澄清效果差異逐漸減小。當(dāng)殼聚糖和果膠酶的添加量達(dá)到8 g/L 和10 g/L 時，兩種澄清劑處理的山荔枝酒精飲料的透光度之間無顯著性差異（P＞0.05）。通過綜合用量和飲料的透光率，對比分析4 種澄清劑的澄清效果，可以看出其效果呈現(xiàn)出果膠酶＞殼聚糖＞硅藻土＞明膠的趨勢。果膠酶在較低用量，即添加6 g/L 時，山荔枝酒精飲料透光率達(dá)到最高。因此，選取果膠酶作為山荔枝酒精飲料的澄清劑。

2.4 山荔枝酒精飲料中的酚類物質(zhì)及抗氧化活性分析

2.4.1 酚類物質(zhì)

通過優(yōu)化工藝后（發(fā)酵溫度27 ℃，酵母接種量0.8%，初始糖度180 g/L，以果膠酶為澄清劑），對生產(chǎn)出的山荔枝酒精飲料的總酚、總黃酮含量進(jìn)一步測定。根據(jù)上述試驗方法中測出的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出總酚的含量90.74±0.23 μg/mL，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算飲料中的黃酮含量24.66±0.08 μg/mL。

通過LC-MS 分析，得到山荔枝酒精飲料中酚類物質(zhì)在負(fù)離子模式下的總離子流圖（如圖2 所示）。結(jié)合已有文獻(xiàn)對酚類物質(zhì)的研究結(jié)果，并根據(jù)總離子流圖中對應(yīng)的保留時間/質(zhì)荷比以及二級碎片離子對飲料中酚類物質(zhì)進(jìn)行鑒定，共推斷出7 種主要成分（如表7 所示），包括奎寧酸、水楊酸己糖苷、咖啡酰己糖苷、單咖啡酰奎尼酸、香橙苷、對香豆酸等。

表7 山荔枝酒精飲料中主要成分的LC-MS 鑒定Table 7 Identification of main components of litchi alcoholic beverage by LC-MS

2.4.2 DPPH·自由基清除能力

山荔枝酒精飲料的DPPH·自由基清除活性結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可以看出，飲料對DPPH·自由基具有較好的清除能力，并且呈現(xiàn)量效關(guān)系。隨著樣品濃度升高，其DPPH·自由基清除活性能力也隨之升高，但升高程度逐漸降低，如樣品濃度在20～80 μg/mL 之間，清除率變化幅度已很小，說明此濃度下飲料中的DPPH·自由基基本上已經(jīng)被清除，在80 μg/mL 時清除率達(dá)到最大，為90.3%±0.22%，這與Kaustav 等[26]的試驗結(jié)果相似，荔枝飲料DPPH·自由基清除率可達(dá)到86.7%±0.17%。本研究結(jié)果證明山荔枝酒精飲料具有很好的DPPH·自由基清除活性，可以用來清除人體內(nèi)過多的自由基，從而避免人體組織器官受到自由基的氧化損傷。

3 結(jié)論

本文以云南山荔枝為試驗原料，研究了山荔枝低酒精度飲料的發(fā)酵工藝、澄清工藝，以及飲料中總酚、總黃酮含量、酚類物質(zhì)的組成及其抗氧化性。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵工藝條件為初始糖度180 g/L，發(fā)酵溫度27 ℃，酵母接種量0.8%，最優(yōu)的澄清劑為果膠酶（果膠酶濃度為6 g/L時，其透光率可達(dá)到95%）。通過測定總酚、總黃酮含量及分析多酚組分發(fā)現(xiàn)，山荔枝酒精飲料中多酚含量為90.74 μg/mL，黃酮含量為24.66 μg/mL，主要多酚組分包括水楊酸己糖苷、咖啡酰己糖苷、單咖啡?？崴帷⑾愠溶?、對香豆酸、木犀草素、槲皮苷等7 種。同時，山荔枝酒精飲料對DPPH·自由基具有較好的清除能力，在較低濃度條件下對DPPH 的清除率可達(dá)到80%以上。

綜上所述，開發(fā)以山荔枝為主要原料的發(fā)酵低酒精度的飲料，不僅可以豐富云南特色山荔枝產(chǎn)品的種類，而且還能夠開發(fā)出具有較高抗氧化功能特性的果酒飲料，對推動地方產(chǎn)業(yè)發(fā)展、提升消費者健康具有重要的意義。