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    關(guān)于DMSO和BSA對(duì)全血DNA擴(kuò)增的影響研究及對(duì)比

    2020-03-24 11:51:15李雨衡林仁露劉泉
    科技風(fēng) 2020年9期
    關(guān)鍵詞:血紅素

    李雨衡 林仁露 劉泉

    摘要:目的為了使在犯罪現(xiàn)場(chǎng)提取的微量有污染的DNA可以被準(zhǔn)確檢測(cè)出來(lái)。方法通過(guò)使用全血樣本,在進(jìn)行PCR直擴(kuò)過(guò)程中加入DMSO或BSA,并測(cè)序后得出最后結(jié)果,比較兩種試劑的增強(qiáng)效果。結(jié)果兩種方法都不同程度的提高了DNA的擴(kuò)增量,使其檢出率大大提高了。結(jié)論2mg/ml的BSA,0.4mg/ml的DMSO很大程度的提高了DNA的擴(kuò)增量和檢出率。

    關(guān)鍵詞:全血樣本;血紅素;PCR;STR;DMSO;BSA

    作為目前法醫(yī)物證檢驗(yàn)鑒定的常規(guī)技術(shù),對(duì)生物檢材中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增是DNA分型中的一個(gè)重要環(huán)節(jié),而要使DNA分型能夠順利進(jìn)行,就必須提高PCR擴(kuò)增的高效性和靈敏性。在刑事案件現(xiàn)場(chǎng)收集到的DNA檢材通常會(huì)有一定的污染,其會(huì)使檢材無(wú)法被準(zhǔn)確檢測(cè)出來(lái),這也是PCR擴(kuò)增失敗的主要原因。

    目前,血液中的血紅素已被證實(shí)為PCR抑制物之一[1],而血液作為刑事案件中常見(jiàn)的生物檢材,在PCR領(lǐng)域中具有較高的研究?jī)r(jià)值。當(dāng)前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者的大量研究以及法醫(yī)學(xué)的大量實(shí)踐可證實(shí),一定濃度的DMSO或者BSA可提高DNA擴(kuò)增量,但超過(guò)一定濃度也會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率的降低,且它們的濃度數(shù)值關(guān)系研究得不夠清楚。盡管市場(chǎng)上已存在很多全血直擴(kuò)試劑盒,但由于對(duì)相關(guān)促進(jìn)PCR擴(kuò)增試劑濃度數(shù)值關(guān)系的不確定,造成其擴(kuò)增效力也不盡相同。通過(guò)本次課題研究,對(duì)比出DMSO和BSA對(duì)PCR擴(kuò)增的影響大小,以及各個(gè)合適濃度值來(lái)作為PCR增強(qiáng)劑。

    1 材料

    1.1 檢材提取

    采血前讓志愿者洗凈雙手,并用70%乙醇溶液消毒。用采血器采血后用吸血器吸取,然后滴取在已消毒的濾紙上。標(biāo)明姓名和時(shí)間。

    1.2 儀器

    (1)分析天平。

    (2)移液器。

    (3)震蕩儀。

    (4)打孔器。

    (5)純水儀。

    (6)高速離心機(jī)。

    (7)7500PCR擴(kuò)增儀(由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供)。

    (8)3500測(cè)序儀(由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供)。

    1.3 試劑

    (1)A27plex試劑盒。

    (2)BSA(10mg/ml)。

    (3)DMSO(1.1mg/ml)。

    (4)Taq DNA聚合酶。

    (5)甲酰胺。

    (6)Ladder。

    (7)Liz內(nèi)標(biāo)。

    1.4 主要試劑配制

    (1)BSA:分別取0.01g、0.02g、0.03g、0.04gBSA于2mlEP管中,加入純水至2ml。使其濃度依次為5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml。

    (2)DMSO:取濃度為1.1g/ml的DMSO2ml分裝在2mlEP管中。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 PCR擴(kuò)增步驟

    2.1.1 DMSO實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增前的實(shí)驗(yàn)步驟

    (1)在帶有血樣的濾紙上標(biāo)上姓名及采血時(shí)間后待其晾干。

    (2)取0.2mlEP管6個(gè)放置于孔板上。

    (3)用已消毒的打孔器在有血樣的濾紙片上打孔(每次一下),將所得血樣粒放入0.2mlEP管中,每個(gè)EP管中放置兩粒。

    (4)取1個(gè)0.2mlEP管放置在孔板上。

    (5)取24μLMix,12μLPrimer,2.4μLTaq DNA聚合酶于一0.2mlEP管中,并置于震蕩器混勻。

    (6)將最大量程為10μL的移液器調(diào)至6.4μL,將(2)中混合液取6.4μL,分裝于6個(gè)含有血樣的0.2mlEP管中。

    (7)將6個(gè)0.2ml1EP管分別標(biāo)號(hào)為HO(對(duì)照)、HD0.2、HD0.4、HD0.6、陰性和陽(yáng)性。

    (8)然后依次加入3.6μLddH2O、0.2μLDMSO和3.4μLddH2O、0.4DMSO和3.2μLddH2O、0.6μLDMSO和3μLddH2O、3.6μLddH2O、1μL DNA Contral 9947A和2.6μLddH2O。

    (9)將其放置于高速離心機(jī)中以4930rpm速率離心10秒。

    2.1.2 BSA實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增前的實(shí)驗(yàn)步驟

    (1)在帶有血樣的濾紙上標(biāo)上姓名及采血時(shí)間后待其晾干。

    (2)取0.2mlEP管6個(gè)放置于孔板上。

    (3)用已消毒的打孔器在有血樣的濾紙片上打孔(每次一下),將所得血樣粒放入0.2mlEP管中,每個(gè)EP管中放置兩粒。

    (4)取1個(gè)0.2mlEP管放置在孔板上。

    (5)取24μLMix,12μLPrimer,2.4μLTaq DNA聚合酶于一0.2mlEP管中,并置于震蕩器混勻。

    (6)將最大量程為10μL的移液器調(diào)至6.4μL,將(2)中混合液取6.4μL,分裝于6個(gè)含有血樣的0.2mlEP管中。

    (7)將6個(gè)0.2ml1EP管分別標(biāo)號(hào)為HO(對(duì)照)、HD0.2、HD0.4、HD0.6、陰性和陽(yáng)性。

    (8)然后依次加入3.6μLddH2O、0.2μLDMSO和3.4μLddH2O、0.4DMSO和3.2μLddH2O、0.6μLDMSO和3μL ddH2O、36μLddH2O、1μLDNA Contral 9947A和2.6μLddH2O。

    (9)將其放置于高速離心機(jī)中以4930rpm速率離心10秒。

    2.2 PCR擴(kuò)增熱循環(huán)參數(shù)

    (1)95℃預(yù)變性2min;

    (2)94℃10s,60℃1.5min,循環(huán)28次;

    (3)60℃延伸20min;

    (4)4℃保溫。

    2.3 測(cè)序步驟

    2.3.1 DMSO實(shí)驗(yàn)的測(cè)序的實(shí)驗(yàn)步驟

    (1)取72μL甲酰胺,1.6μL Liz于0.2mlEP管中,并用移液器吹打若干次。

    (2)將最大量程為10μL的移液器調(diào)至9.2μL,并將(1)中混合液按照順序以9.2μL分裝至96孔板中。

    (3)順次加入1μL Ladder,1μL 陽(yáng)性對(duì)照,1μL陰性對(duì)照,1μLH0,1μLHD0.2,1μLHD0.4,HD0.6。

    (4)將孔板蓋好后放入平板高速離心離心機(jī)中以4930rpm速率離心30秒后取出。

    2.3.2 BSA實(shí)驗(yàn)的測(cè)序前的實(shí)驗(yàn)步驟

    (1)取81μL甲酰胺,1.8μL Liz于0.2mlEP管中,并用移液器吹打若干次。

    (2)將最大量程為10μL的移液器調(diào)至9.2μL,并將(1)中混合液按照順序以9.2μL分裝至96孔板中。

    (3)順次加入1μL Ladder,1μL陽(yáng)性對(duì)照,1μL陰性對(duì)照,1μLH0,1μLHB0.5,1LHB1.0,HB1.5,HB2.0,HB3.0,HB6.0,HB9.0。

    (4)將孔板蓋好后放入平板高速離心離心機(jī)中以4930rpm速率離心30秒后取出。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    由于基因峰值升降趨勢(shì)大致相同,故隨機(jī)抽取三對(duì)堿基:D7S820,D18S51,D8S1179為例進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

    3.1 DMSO對(duì)全血PCR擴(kuò)增效率影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表(如表1所示)

    3.1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

    根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可得,當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為0至4%時(shí),DMSO對(duì)全血樣本PCR擴(kuò)增效率隨著DMSO體積分?jǐn)?shù)的升高而升高;當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為4%至6%時(shí),DMSO對(duì)全血樣本擴(kuò)增效率隨著DMSO體積分?jǐn)?shù)的升高而降低。其中,根據(jù)統(tǒng)計(jì)圖中峰值可判斷出DMSO對(duì)提升全血樣本擴(kuò)增效率的最適體積分?jǐn)?shù)是在4%,由此得出關(guān)于DMSO的一種增強(qiáng)劑為0.4mg/ml的DMSO。

    3.2 BSA對(duì)全血PCR擴(kuò)增效率影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.2.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表(如表2)

    3.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

    根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可得,當(dāng)BSA濃度為0至2mg/ml時(shí),BSA對(duì)全血樣本PCR擴(kuò)增效率隨著B(niǎo)SA濃度升高而升高;當(dāng)BSA濃度為3至9mg/ml時(shí)BSA對(duì)全血樣本PCR擴(kuò)增效率基本進(jìn)入平臺(tái)期。其中,當(dāng)BSA為2mg/ml時(shí)全血樣本PCR擴(kuò)增效率最為明顯,由此得出關(guān)于BSA的增強(qiáng)劑為2mg/ml的BSA。

    3.3 組間實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

    根據(jù)表1、2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),可得當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為4%、BSA濃度為2mg/ml分別對(duì)應(yīng)提高全血PCR擴(kuò)增效率的最佳濃度。

    對(duì)于上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)兩種不同的增強(qiáng)劑對(duì)于不同的基因鏈條擴(kuò)增效果的影響不同,但相對(duì)于空白組H0都較大程度增加了DNA的擴(kuò)增量。從局部來(lái)看,單獨(dú)使用BSA(HB2.0)的效果普遍獲得的堿基數(shù)量針對(duì)基因D7S820擴(kuò)增量是最高的,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)DMSO(HD0.4),但對(duì)于剩余兩組基因單獨(dú)使用DMSO(HD0.4)要比BSA(HB2.0)擴(kuò)增所得的堿基數(shù)量要高一些,由此無(wú)法對(duì)比出兩者對(duì)于PCR反應(yīng)的影響大小。

    4 討論

    4.1 兩種試劑對(duì)全血PCR效率影響的實(shí)驗(yàn)分析

    由于本實(shí)驗(yàn)采用四色熒光測(cè)序,并且根據(jù)最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,DNA峰值升降趨勢(shì)相同,因此以每一組熒光所代表的堿基對(duì)為單位,從每一組熒光測(cè)序組中隨機(jī)選擇一對(duì)堿基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

    4.1.1 對(duì)加入DMSO的實(shí)驗(yàn)分析

    DMSO是一種無(wú)色無(wú)味透明液體,有吸水性,分子式為,見(jiàn)圖4。分子含有一個(gè)極性非常高的鍵和兩個(gè)相同的非極性基團(tuán),因此,它既可溶于非極性溶劑又可溶于極性溶中,因?yàn)檫@種物理化學(xué)特性,可以作為一些不溶于水的化合物的有效溶劑,并且可以破壞水分子之間的氫鍵。工業(yè)上被用于溶劑和萃取劑。在生物學(xué)研究中,它可以作為一個(gè)優(yōu)良的溶劑,而在醫(yī)藥治療中,它可以作為有效的溶媒介物,因此可以用于PCR整個(gè)反應(yīng)體系使之充分混合,同時(shí)DMSO也作為變性劑可直接解除模板DNA的局部二級(jí)結(jié)構(gòu),從而增加引物和模板的特異性結(jié)合,降低非特異性結(jié)合,最終獲得滿意的擴(kuò)增效果。

    在徐葵,邱志明,汪曉英《DMSO對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響》一文中[3],受解決δ受體基因?qū)掖问?,從而使用體積分?jǐn)?shù)為6%至13%DMSO時(shí),使其順利擴(kuò)增的啟發(fā)。將預(yù)實(shí)驗(yàn)中DMSO的體積分?jǐn)?shù)分別定為6%,8%和10%。但實(shí)際操作中,用體積分?jǐn)?shù)為6%,8%和10%的DMSO進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示,當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)超過(guò)6%時(shí),會(huì)對(duì)全血樣本PCR的擴(kuò)增效率起到抑制作用。因此,以6%的體積分?jǐn)?shù)為界限,研究體積分?jǐn)?shù)為2%,4%,6%時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

    通過(guò)對(duì)表1和圖1的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可得,當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為2%至4%時(shí),全血PCR擴(kuò)增效率逐漸升高,在其體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí)達(dá)到峰值;其體積分?jǐn)?shù)超過(guò)4%后,全血PCR擴(kuò)增效率逐漸降低??煞治龀觯瑢?duì)A21plex試劑盒而言,當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)小于4%時(shí),可直接接觸全血DNA模板的局部二級(jí)結(jié)構(gòu),加強(qiáng)引物和全血DNA模板的特異性結(jié)合;當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)大于4%時(shí),DMSO會(huì)對(duì)Taq DNA聚合酶產(chǎn)生抑制作用。而Taq DNA聚合酶作為PCR擴(kuò)增所需材料,一旦其失去活性,會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率的下降。

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