CPP誘導(dǎo)無定型磷酸鈣及羥基磷灰石在牛牙釉質(zhì)再礦化中的應(yīng)用比較

劉 萍 伍 鵬 寧科功

(云南白藥集團股份有限公司 云南 昆明650217)

引言

酪蛋白磷酸肽( casein phosphopeptide，CPP)是由牛乳酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶降解產(chǎn)生的富含成簇磷酸絲氨酰基的多肽。研究表明CPP 通過自身結(jié)構(gòu)中大量的磷酰基團，在中性或堿性條件下可結(jié)合亞穩(wěn)定狀態(tài)的無定型磷酸鈣( amorphous calcium phosphate，ACP) ，形成酪蛋白磷酸肽-無定型磷酸鈣復(fù)合物( casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate，CPPACP)，顯著增強磷酸鈣的溶解能力[1]，增加牙釉質(zhì)表面鈣離子和磷酸離子濃度，有利于牙齒表層再礦化。

羥基磷灰石(HAP Ca10(PO4)6(OH)2)是人牙釉質(zhì)的主要無機成分，約占總成分的97%以上,基本單元是針狀和柱狀的磷灰石晶體[1], 長約40nm, 寬約20nm.牙釉質(zhì)再礦化的化學(xué)本質(zhì)是磷酸鈣體系的結(jié)晶過程；HAP生成經(jīng)歷由磷酸八鈣〔Ca8H2(PO4)6·5H2O〕→非晶態(tài)磷酸鈣〔Ca8(PO4)2·XH2O〕→缺鈣磷灰〔Ca10-Z(HPO4)Z(PO4)6-Z(OH)2-Z·XH2O→羥基磷灰石〔Ca10(PO4)6(OH)2·XH2O〕的復(fù)雜的相轉(zhuǎn)變過程[2,5]；鑒于納米羥基磷灰石特殊作用, 而其形狀和尺寸是其顯示納米效應(yīng)的關(guān)鍵, 因此,對納米HAP晶體的生成進行有效調(diào)控, 以制備出與牙釉質(zhì)相同結(jié)晶形態(tài)，并能夠生長于原釉質(zhì)上的HAP就可以修復(fù)受損牙釉質(zhì)；盡管羥基磷灰石同牙釉質(zhì)中的無機成分相似, 具有優(yōu)良的生物學(xué)性能。但是羥基磷灰石在牙表面降解緩慢, 因此采用非結(jié)晶形態(tài)的無定型磷酸鈣來直接代替穩(wěn)定的羥基磷灰石作為牙釉質(zhì)再礦化的鈣、磷源，可以改善降解性能及增強釉質(zhì)再礦化速度。

本研究以CPP為誘導(dǎo)劑，分別將羥基磷灰石及無定型磷酸鈣作為鈣、磷源，分別對受損牛齒牙釉質(zhì)進行再礦化比較；以期找出能夠修復(fù)受損牛牙釉質(zhì)的方法；并展望了該技術(shù)在修復(fù)人牙釉質(zhì)中的應(yīng)用。

1 實驗部分

1.1主要試劑和儀器

CPP( WAKO，日本)；羥基磷灰石(上海紫臨生物科技有限公司)；JSM-6460掃描電鏡(SEM)(日本JEOL會社); 維氏硬度計(THVS-5Z)。

1.2實驗樣本制備

選取同一環(huán)境下同一批次的牛牙，收集新拔除的牛下切牙，體視顯微鏡(×10) 選唇側(cè)釉質(zhì)完整、表面光滑、顏色正常、無白斑、無裂痕、無磨損的牙;去凈軟組織，超聲洗滌，切取冠部釉質(zhì)塊。每個釉質(zhì)塊的唇側(cè)用800目砂紙磨出小平面，超聲洗滌，取3mm×2mm開窗區(qū)，其余部分用抗酸指甲油封閉，生理鹽水冷藏(4℃) 保存?zhèn)溆肹3]。

1.3實驗溶液配制

1.3.1配制CPP-ACP礦化液:2g CPP溶解于144mmol /L磷酸鈉緩沖液( pH=7.0)50ml中，電磁力攪拌器攪拌，逐滴加入1mol /L的CaCl2溶液12ml，用KOH 維持恒定pH值; 用去離子水調(diào)整溶液體積至100ml。最終配制含2%CPP，120mmoL/L CaCl2，72mmoL/L磷酸鈉( pH=7.0) 的CPP-ACP溶液[4]。經(jīng)倍比稀釋得到1%CPP-ACP和0.5% CPP-ACP溶液。

1.3.2羥基磷灰石礦化液：分別將0.5g、1g、2g CPP溶解于100ml水中，并分別加入2g的固體羥基磷灰石粉末，磁力攪拌混合2h備用。

1.3.3配制人工唾液:0.07g CaCl2，0.04g MgCl2，2.23g KCl,0.54g KH2PO4，4.76g羥乙基哌嗪乙磺酸溶于800mL去離子水中，用NaOH調(diào)pH值至7.0，去離子水定容至1000mL。

1.4牙釉質(zhì)修復(fù)實驗

取56個釉質(zhì)塊標(biāo)本隨機分為7組，每組8個樣本，分別置于0.5% CPP-ACP溶液、1.0% CPP-ACP溶液、2.0% CPP-ACP溶液、0.5% CPP-HAP混合液、1% CPP-HAP混合液、2% CPP-HAP混合液和去離子水7種溶液中;37℃水浴振蕩15min后取出；放入按1∶1的比例配制的人工唾液中，37℃恒溫保存。每日(24h)取出釉質(zhì)塊，重復(fù)以上步驟，共15天。然后取出牙釉質(zhì)塊，吹干，通過掃描電鏡觀察受損牙釉質(zhì)再礦化情況。

1.5礦化修復(fù)后牙釉質(zhì)硬度的測定

在維氏顯微硬度計測定各實驗樣品的表面硬度，載荷50g，保荷15s。每個釉質(zhì)塊表面每個區(qū)域測3個點，各點相距200～300μm，結(jié)果取平均值[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1CPP-ACP對牙釉質(zhì)修復(fù)的影響

圖1～圖4是牛牙釉質(zhì)及其在不同濃度的CPP-ACP中的再生情況的SEM圖片。

圖1 牛牙釉質(zhì)表面SEM

圖2 0.5%CPP-ACP對牛牙釉質(zhì)修復(fù)的SEM

圖3 1% CPP-ACP對牛牙釉質(zhì)修復(fù)的SEM

圖1.1 牛牙釉質(zhì)表面EDS Ca:P=1.95

圖2.1 0.5%CPP-ACP對牛牙釉質(zhì)修復(fù)的EDS Ca:P=1.83

圖3.1 1% CPP-ACP對牛牙釉質(zhì)修復(fù)的EDS Ca:P=1.99

圖4 2% CPP-ACP對牛牙釉質(zhì)修復(fù)的SEM

圖4.1 2% CPP-ACP對牛牙釉質(zhì)修復(fù)的EDS Ca:P=1.99

圖1.1是空白牛齒的EDS,空白受損牛齒表面為柱狀羥基磷灰石結(jié)晶，其鈣磷比為Ca:P=1.95；實驗結(jié)果顯示，0.5%～2.0% CPP-ACP均可促進受損牛牙釉質(zhì)沿固有方向生長，相同時間內(nèi)0.5%、1%、2%的CPP-ACP誘導(dǎo)牙釉質(zhì)沿固有方向生長的長度分別是：小于10nm、介于10nm～50nm、大于50nm; 高濃度的CPP-ACP能更好的誘導(dǎo)受損牛齒表面的羥基磷灰石沿固有方向生長；且當(dāng)濃度大于1%以后，其鈣磷比Ca:P=1.99與原釉質(zhì)的Ca:P=1.95更接近；對受損牛牙釉質(zhì)修復(fù)效果更好。

2.2CPP-HAP對受損牛牙釉質(zhì)修復(fù)的影響

圖5、圖6、圖7分別是不同濃度CPP-HAP對受損牛牙釉質(zhì)修復(fù)情況的SEM及EDS圖，圖片顯示各個濃度下CPP-HAP皆能在受損牛牙釉質(zhì)表面形成不規(guī)則的結(jié)晶，且致密程度比CPP-ACP更緊密，新長出的礦物質(zhì)呈層狀堆積；鈣磷比與未礦化的牛牙釉質(zhì)(Ca:P=1.95)相近分別是1.96、1.83、1.93；說明在受損牛牙釉質(zhì)表面形成的磷酸鈣鹽結(jié)合形式也是羥基磷灰石形態(tài)，但其結(jié)晶生長形態(tài)與原牛牙釉質(zhì)完全不同，隨CPP濃度增加，再礦化的牛牙釉質(zhì)厚度增加，但呈非有序、非連續(xù)狀態(tài)。

圖5 0.5%CPP-HAP對牛牙釉質(zhì)修復(fù)的SEM

圖6 1%CPP- HAP對牛牙釉質(zhì)修復(fù)的SEM

圖 5.1 0.5%CPP-HAP對牛牙釉質(zhì)修復(fù)的EDS Ca:P=1.96

圖6.1 1%CPP-HAP對牛牙釉質(zhì)修復(fù)的EDS Ca:P=1.83

圖7 2%CPP-HAP對牛牙釉質(zhì)修復(fù)的SEM圖

圖7.1 2%CPP-HAP對牛牙釉質(zhì)修復(fù)的EDS Ca:P=1.93

2.3硬度

表1是受損牛牙釉質(zhì)在不同再礦化液中生長15天后，吹干，并用維氏顯微硬度計測定各實驗樣品的表面硬度，載荷50g，保荷15s。每個釉質(zhì)塊表面每個區(qū)域測3個點，各點相距200～300μm，結(jié)果取平均值，從表1可知，無論是CPP-ACP還是CPP-HAP再生的牙釉質(zhì)硬度都無法直接達到原釉質(zhì)的硬度293HV；CPP-ACP誘導(dǎo)原釉質(zhì)有序生長，新長出的釉質(zhì)硬度與原釉質(zhì)接近，且隨CPP濃度增加釉質(zhì)硬度增強，最大硬度為252HV;而CPP-HAP誘導(dǎo)再生的牙釉質(zhì)硬度下降較大，其硬度依然隨CPP濃度的增大而增強,最大硬度為182HV。

表1 受損牛牙釉質(zhì)在不同再礦化液中再礦化15天后的硬度表

2.4討論

從以上實驗結(jié)果來看，盡管牛牙釉質(zhì)中的主要無機物是羥基磷灰石，然而在修復(fù)受損牛牙釉質(zhì)的實驗中，酪蛋白磷酸肽(CPP)誘導(dǎo)無定型磷酸鈣可以更好的修復(fù)牙釉質(zhì)，且可以誘導(dǎo)新長出的釉質(zhì)沿其固有方向生長，形成的新釉質(zhì)硬度與原釉質(zhì)硬度更接近，酪蛋白磷酸肽也可以直接誘導(dǎo)結(jié)晶型羥基磷灰石再礦化修復(fù)受損牛牙釉質(zhì)，但是不能夠誘導(dǎo)原釉質(zhì)沿固有方向結(jié)晶，而是在受損牛牙釉質(zhì)表面形成片層結(jié)構(gòu)，且硬度比原釉質(zhì)小100HV以上；二者相比CPP-ACP效果更好的原因，牙釉質(zhì)再礦化的化學(xué)本質(zhì)是磷酸鈣體系的結(jié)晶過程；從晶體結(jié)晶過程需要三個階段，一是過飽和溶液形成，二是形成晶核，第三是形成晶體[1,7,8]；在牛牙釉質(zhì)再生這個過程中晶核的形成過程是取決定性作用的過程和勢能最大的過程，CPP-ACP體系過飽和溶液中鈣和磷都是以離子的形態(tài)存在；晶核的形成是以受損牛齒釉質(zhì)本身的晶體為晶核來生長的，加上CPP本身通過電荷吸附于牛齒釉質(zhì)表面[5,8]誘導(dǎo)新形成的羥基磷灰石生長，隨著CPP-ACP濃度的增加，其維持鈣磷離子濃度的能力提高，再礦化效果亦增加。所以形成的新釉質(zhì)與原釉質(zhì)層性狀及硬度都更加接近；而在CPP-HAP體系中，雖然體系中的HAP與原釉質(zhì)的組成一致，但是要修復(fù)牙釉質(zhì)，則需讓已經(jīng)結(jié)晶的HAP經(jīng)歷溶解形成過飽和鈣、磷離子體系，再經(jīng)過CPP誘導(dǎo)成核再結(jié)晶的過程[9,10]，因為HAP在該體系的溶解度很低，所以很難形成高濃度的過飽和溶液，再加上本來HAP具有一定的結(jié)晶形態(tài)，當(dāng)溶解以后，過飽和離子因其成核需要的勢能過高，更傾向于在原來的HAP晶核上再結(jié)晶，雖然經(jīng)CPP誘導(dǎo)其再礦化過程也發(fā)生在受損牛齒的表面，但其結(jié)晶形態(tài)則受到添加的HAP自身的結(jié)晶形態(tài)影響，形成了片層結(jié)構(gòu)，其結(jié)晶形態(tài)的不同亦導(dǎo)致硬度與固有釉質(zhì)的硬度差異。

3 結(jié)論與展望

在人工唾液及37℃培養(yǎng)箱中，CPP-ACP體系及CPP-HAP體系均可以誘導(dǎo)受損牛齒釉質(zhì)礦化再生；且再生程度隨CPP濃度增加而增加；CPP-ACP體系誘導(dǎo)再生牛牙釉質(zhì)的能力大于CPP-HAP體系，與原釉質(zhì)結(jié)晶形態(tài)、鈣磷比及硬度都更加結(jié)近，CPP-ACP可以提供更有利于牛牙釉質(zhì)再生所需要的鈣、磷離子，且沒有其它晶核影響再礦化晶體生長，在CPP的誘導(dǎo)下再礦化的新釉質(zhì)更傾向于沿固有晶體結(jié)構(gòu)生長，更有利于新釉質(zhì)的形成；本實驗采用的是與人齒結(jié)近的牛齒為研究對象，雖然研究結(jié)果中新生的牛牙釉質(zhì)與原釉質(zhì)還有一定的差別，但基本達到了受損牛牙釉質(zhì)再生的目的；由于采用的原料安全，該實驗也有望在人牙釉質(zhì)再生中實現(xiàn)，可以徹底改變通過氟化物來強化牙釉質(zhì)的現(xiàn)狀，從而解決氟化物可能引起的中毒等問題，同時牙釉質(zhì)是牙齒第一層保護基質(zhì)，牙釉質(zhì)修復(fù)技術(shù)可以解決牙齒的敏感、蛀牙、美白等問題，其應(yīng)用前景非常廣闊。