含溶菌酶的兒童牙膏研究開發(fā)

耿帥峰 褚夫江 徐天生 歐陽(yáng)學(xué)琭 李 婷

(1.好易康生物科技(廣州)有限公司，廣東廣州 510320；2.廣東藥科大學(xué)，廣東廣州 510006)

隨著人民生活水平和文明程度的提高，人們對(duì)口腔的健康越來越重視。每個(gè)人要想有個(gè)良好的口腔，所以每天的口腔護(hù)理是必不可少的；但要想提高全社會(huì)的整體口腔健康水平，就應(yīng)該從兒童時(shí)期引導(dǎo)其口腔護(hù)理，養(yǎng)成規(guī)律性的口腔清潔護(hù)理習(xí)慣。在日常生活中，兒童由于缺乏自覺性和認(rèn)識(shí)，平時(shí)喜歡吃高糖食品，以及父母沒有很好引導(dǎo)致使其出現(xiàn)牙齒齲病、疼痛等癥狀。幼兒是牙齒發(fā)育的重要時(shí)期，兒童的口腔黏膜抵抗外界刺激能力較差，其牙齒嫩弱易受外力傷害、易于產(chǎn)生蛀牙，因此保障幼兒的口腔健康是讓其茁壯成長(zhǎng)的關(guān)鍵。當(dāng)前，兒童牙膏的主要成分是以成人牙膏為基準(zhǔn)， 只是相應(yīng)減少一些可能造成兒童身體損傷的成分。在一些功效成分牙膏中，兒童牙膏相對(duì)于成人牙膏，只是簡(jiǎn)單的減少功效成分含量，這樣也會(huì)相應(yīng)地減弱了兒童牙膏保護(hù)口腔健康的作用。

溶菌酶是一種非特異性物質(zhì)成分，可以抑制微生物生長(zhǎng)；與抗生素或其他抑菌物質(zhì)對(duì)比，長(zhǎng)期使用溶菌酶不會(huì)出現(xiàn)抗藥性[1]。溶菌酶能選擇性地溶解目標(biāo)微生物細(xì)胞壁而使其失活，哺乳動(dòng)物無細(xì)胞壁，因此，溶菌酶對(duì)口腔組織無損傷，而是起到保護(hù)作用，將其添加到口腔護(hù)理用品中抑制口腔常見致病微生物具有較好的推廣和應(yīng)用前景[2]。

低聚果糖是一種益生元，低聚果糖可以選擇性的增殖雙歧桿菌，從而調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，維持腸道健康。低聚果糖作為水溶性膳食纖維，攝入后可刺激腸道蠕動(dòng)，改變腸道內(nèi)容物的滲透壓，增加糞便水分，起到潤(rùn)腸通便、緩解便秘的作用。低聚果糖還可有效降低體內(nèi)游離脂肪酸、甘油三脂和血清膽固醇的含量，對(duì)動(dòng)脈硬化、高血壓等心血管疾病有改善作用[3-5]。低聚果糖被腸道細(xì)菌發(fā)酵，產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸和乳酸等，降低腸道環(huán)境pH值，抑制有害細(xì)菌和病原菌的生長(zhǎng)繁殖，減少場(chǎng)內(nèi)毒素和腐敗物質(zhì)的產(chǎn)生和積累。優(yōu)良的理化特性和生理功效使其得到廣泛的應(yīng)用[6-8]。

本研究著力從復(fù)配溶菌酶和低聚果糖的角度，去完善單一功能物質(zhì)的不足，篩選安全輔料，研制安全且能更好有益于兒童健康成長(zhǎng)的牙膏。

1 材料與方法

1.1材料

溶菌酶樣品為好易康生物科技(廣州)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供，低聚果糖樣品為量子高科(中國(guó))生物股份有限公司提供，山梨醇樣品為山東天力藥業(yè)有限公司，黃原膠樣品為廣州浩天新材料有限公司，其他相關(guān)輔料均由市面采購(gòu)的食品級(jí)原材料。

變異鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌由廣東省微生物研究所提供；涉及的試劑均為分析純。

1.2溶液配制

1.2.1溶菌酶水溶液的制備

準(zhǔn)確稱量0.1g、0.2g、0.4g、0.6、1g、2g溶菌酶樣品，分別溶于50mL水中，最后定容至100mL，分別得0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、1%和2%含量的溶菌酶水溶液。

1.2.2低聚果糖水溶液的制備

準(zhǔn)確稱量0.5g、1g、2g、3g、4g和5g低聚果糖樣品，分別溶于50mL水中，最后定容至100mL，分別得0.5%、1%、2%、3%、4%和5%含量的低聚果糖水溶液。

1.3抑菌效果檢測(cè)方法

按照《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評(píng)價(jià)方法(QB2738-2012)》中7.3作為檢測(cè)依據(jù)，以對(duì)變異鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制率為考察指標(biāo)，對(duì)物質(zhì)的抑菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體操作方法如下：

①用PBS(0.03mol/L磷酸鹽緩沖液)液將變異鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌稀釋成濃度為1×104～9×104cfu/mL；

②將試驗(yàn)樣品用無菌標(biāo)準(zhǔn)硬水稀釋至合適低濃度；

③吸取試驗(yàn)樣品原液5.0mL放入滅菌試管中，20℃恒溫5min；

④吸取試驗(yàn)菌液0.1mL加入到含5.0mL樣品的試管中，迅速混勻，并立即計(jì)時(shí)；

⑤作用3min后，取試驗(yàn)菌與樣品混合液0.5mL，加入到含4.5mL經(jīng)滅菌的PBS試管中，充分混勻；

⑥放置10min后，吸取樣液1mL，置于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)樣液接種兩個(gè)滅菌平皿，用涼至40～45℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15mL作傾注，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，(35±2)℃培養(yǎng)48h后，做活菌菌落計(jì)數(shù)；

⑦以PBS替代試驗(yàn)樣品，同時(shí)按以上步驟操作，作為對(duì)照樣品；

⑧實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求其平均值。計(jì)算公式如式1所示。式中，α為對(duì)照樣品平均菌落數(shù)，β為試驗(yàn)樣品平均菌落數(shù)，結(jié)果保留整數(shù)。

1.4抑菌效果測(cè)定

1.4.1溶菌酶水溶液

將以上制得的0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、1.0%、2.0%溶菌酶水溶液共計(jì)6個(gè)樣品按照1.3方法，對(duì)變異鏈球菌(G-)、牙齦卟啉單胞菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G+)4種口腔致病菌進(jìn)行抑菌檢測(cè)。

1.4.2低聚果糖水溶液

將以上制得的0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%低聚果糖水溶液共計(jì)6個(gè)樣品按照1.3方法，對(duì)變異鏈球菌(G-)、牙齦卟啉單胞菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G+)4種口腔致病菌進(jìn)行抑菌檢測(cè)。

1.4.3溶菌酶復(fù)配低聚果糖溶液

在不增加抑菌物用量的前提下，即控制抑菌物質(zhì)的總量為5%，測(cè)試溶菌酶和低聚果糖在復(fù)配比例分別為5∶1、1∶1、1∶5、1∶10、1∶20和1∶50的抑菌效果，從而優(yōu)選最佳的復(fù)配比例。

1.5溶菌酶和低聚果糖復(fù)配物在牙膏用的應(yīng)用

選定目前比較主流的碳酸鈣、磷酸氫鈣2種配方體系作為驗(yàn)證配方，為了盡量避免其他原料的影響，配方中不添加任何其他的功能劑，同時(shí)不添加任何防腐劑。配方設(shè)計(jì)見表1。

表1 配方設(shè)計(jì)

1.6人體腸道菌群的影響實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1受試人群和分組

經(jīng)體檢指標(biāo)全部正常的60名兒童(6～12歲)。

將其隨機(jī)分成試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2和對(duì)照組，每組20人，男女各半；其中試驗(yàn)組1使用的樣品為二氧化硅體系牙膏，試驗(yàn)組2使用的樣品為磷酸氫鈣體系牙膏，對(duì)照組使用的樣品為市售某品牌牙膏(不含溶菌酶、低聚果糖等非功效類普通牙膏)。

1.6.2刷牙方式

受試者統(tǒng)一發(fā)放牙膏及牙刷，按BASS刷牙法，每日早晚各刷牙1次，共2次，每次1min。

1.6.3實(shí)驗(yàn)步驟

在給予受試樣品之前，無菌采取受試者糞便，檢查雙歧桿菌、乳桿菌等數(shù)量指標(biāo)；連續(xù)刷牙30d，最后一次刷牙24h后，無菌采取受試者糞便，再次檢驗(yàn)雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量指標(biāo)。

1.6.4腸道菌群檢測(cè)方法

收集受試者新鮮糞便于便盆中，立即送檢。定量稱取標(biāo)本，10倍稀釋并均漿后，分別接種至各選擇性培養(yǎng)基。

雙歧桿菌：BLL培養(yǎng)基37℃、48h厭氧培養(yǎng)。

乳桿菌：MRS培養(yǎng)基37℃、48h培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1溶菌酶水溶液的抑菌效果測(cè)定

將上述制得含量為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、1.0%、2.0%溶菌酶溶液，按照1.3抑菌效果檢測(cè)方法，對(duì)變異鏈球菌(G-)、牙齦卟啉單胞菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G+)4種口腔致病菌進(jìn)行抑菌檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如下，見表2。

表2 不同濃度溶菌酶抑菌效果

溶菌酶抑菌結(jié)果顯示：隨著溶菌酶水溶液濃度的上升，樣品抑菌率也隨之上升，但當(dāng)濃度上升至0.4%后，抑菌能力提高緩慢，特別溶菌酶濃度為0.6%、1.0%、2.0%的樣品抑菌效果達(dá)到90%以上，且沒有顯著差異；同時(shí)還可以看出，革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)溶菌酶較革蘭氏陰性菌更加敏感。

2.2低聚果糖水溶液的抑菌效果測(cè)定

將上述制得含量為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%低聚果糖溶液，按照1.3抑菌效果檢測(cè)方法，對(duì)變異鏈球菌(G-)、牙齦卟啉單胞菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G+)4種口腔致病菌進(jìn)行抑菌檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如下，見表3。

表3 不同濃度低聚果糖抑菌效果

表3顯示不同含量的低聚果糖溶液對(duì)4種口腔致病菌基本沒有抑菌能力。不論是菌種的差異，還是低聚果糖濃度的高低，四種口腔致病菌表現(xiàn)對(duì)低聚果糖均不敏感。

2.3溶菌酶復(fù)配低聚果糖的抑菌效果

將溶菌酶和低聚果糖按比例為5∶1、1∶1、1∶5、1∶10、1∶20和1∶50的6個(gè)復(fù)配組方，且復(fù)配功效成分的總含量均為5%，將上述配方對(duì)4種口腔致病菌病進(jìn)行抑菌檢測(cè)，結(jié)果見表4。

表4 不同比例的溶菌酶和低聚果糖復(fù)配抑菌效果

從表4可以看出，溶菌酶和低聚果糖復(fù)配組方抑菌率高低基本與溶菌酶含量相關(guān)，低聚果糖的添加既不會(huì)形成增效作用，也不能形成明顯的拮抗作用。因溶菌酶可以抑制口腔致病菌，低聚果糖可以使口腔、腸道有益菌快速增殖，所以總體而言，溶菌酶和低聚果糖復(fù)配具有現(xiàn)實(shí)可行性。

2.42種配方體系的抑菌效果測(cè)定

在二氧化硅體系和磷酸氫鈣體系的牙膏中添加0.45%的溶菌酶復(fù)配4.55%的低聚果糖(比例為1∶10)后，將這兩種體系的牙膏對(duì)4種口腔致病菌的進(jìn)行抑菌檢測(cè)，結(jié)果見表5。

表5 不同配方體系牙膏的抑菌效果

從表5中可以看出，不含任何其他功能劑和防腐劑的兩種牙膏配方體系具有良好抑菌性能。同表4數(shù)據(jù)對(duì)比，此組方應(yīng)用于牙膏中表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌效果。

2.5腸道菌群檢測(cè)結(jié)果

依照1.6人體腸道菌群的影響實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)受試者腸道中雙歧桿菌和乳酸菌進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表6。

表6 腸道菌群檢測(cè)結(jié)果

從表6的結(jié)果可以看出，使用本組方的牙膏受試者的腸道有益菌雙歧桿菌和乳酸菌相比與使用不添加溶菌酶和低聚果糖的普通牙膏的對(duì)照組顯著增加，表明本組方的牙膏可有效增殖腸道有益菌，促進(jìn)兒童和機(jī)體健康良好的發(fā)育。

3 結(jié)論及展望

①溶菌酶具有很好的抑菌效果，0.40%的溶菌酶對(duì)變異鏈球菌(G-)、牙齦卟啉單胞菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G+)4種口腔致病菌已具有良好的抑菌效果；革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)溶菌酶較革蘭氏陰性菌更加敏感。

②低聚果糖對(duì)變異鏈球菌(G-)、牙齦卟啉單胞菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G+)4種口腔致病菌基本沒有抑制生長(zhǎng)的能力。

③溶菌酶與低聚果糖比例在1∶10時(shí)，即溶菌酶含量0.45%，低聚果糖含量4.55%，該組方在二氧化硅體系和磷酸氫鈣體系的牙膏中表現(xiàn)出良好的抑菌效果，同時(shí)抑菌效果明顯強(qiáng)于兩組方單純復(fù)配的抑菌效果。這也充分說明牙膏基料中的成分也具有一定的抑菌效果。

④溶菌酶與低聚果糖比例在1∶10時(shí)，即溶菌酶含量0.45%，低聚果糖含量4.55%，該組方在二氧化硅體系和磷酸氫鈣體系的牙膏，在使用過程中均能很好地促進(jìn)有益菌(雙歧桿菌和乳酸菌)的增殖。

⑤工作的不足之處在于，理論上溶菌酶具有抑菌效果，低聚果糖可以有益菌增殖，該組方使用過程中一方面溶菌酶呈現(xiàn)抑菌效果，一方面低聚果糖通過有益菌增殖與致病菌形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，間接抑制口腔致病菌。本實(shí)驗(yàn)抑菌效果驗(yàn)證方法為體外單一菌種實(shí)驗(yàn)，未進(jìn)行臨床效果驗(yàn)證，無法證明低聚果糖的間接抑菌效果。