提高斷血流提取物指標成分得率的工藝研究

劉文佳 黃光偉 黃 靜 梁雪松

(柳州兩面針股份有限公司，廣西 柳州 545001)

前言

斷血流來源于唇形科風輪菜屬植物風輪菜Clinopodiumchinense (Benth) O. Kuntze和蔭風輪Clinopodiumpdycephalum (Vaniot) C. Y. WuetHsuan植物的干燥地上部分，為2015年版《中華人民共國藥典》收載的常用中藥, 具有涼血、止血之功效, 臨床上是一種止血良藥, 主要用于治療崩漏、尿血、鼻衄、牙齦出血、創(chuàng)傷出血、子宮肌瘤出血等出血癥[1]。斷血流所含成分比較復雜, 主要含有醉魚草皂苷Ⅳb[2,3]，香蜂草苷、橙皮苷、β甾醇[4]，異櫻花素-7-蕓香糖苷、芹菜素[5]、洋芹素[6]，熊果酸[7]、蒲公英賽醇[8]等成分, 其中三萜皂苷類為其主要成分。經現(xiàn)代藥理研究和臨床試驗證明, 其皂苷類成分具有治療各種出血、單純性紫癜、原發(fā)性血小板減少性紫癜等作用[9-12], 其中醉魚草皂苷Ⅳb為有效成分之一。因此, 將斷血流中醉魚草皂苷Ⅳb最大限度地提取出來，對提取物功效具有重要現(xiàn)實意義的。

斷血流提取工藝有水提醇沉法、醇提法、加酶提取法[13]等，水提醇沉法、醇提法使用較為普遍。由于藥典未對斷血流藥材指標成分進行明確規(guī)定，對各研究的制備工藝條件優(yōu)劣無法判斷。因此本研究通過對中藥提取物生產的兩個重要階段提取和濃縮工藝進行研究，進行系統(tǒng)地考察了提取溶劑、提取時間各影響因素對斷血流指標成分醉魚草皂苷Ⅳb提取的影響, 擬優(yōu)選出最佳制備工藝條件, 最大程度提高斷血流提取物指標成分含量，以期為斷血流的進一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎和工藝參考。

1 實驗儀器與藥品試劑

1.1實驗儀器

Agilent1260高效液相色譜儀，配紫外檢測器；旋轉蒸發(fā)器(RE52-98型，上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州萬合儀器制造有限公司)；電子分析天平(METTLER TOLEDO，ML204型)；超聲波清洗機(功率250W，頻率50kHz，廣州維力超聲電子設備有限公司)。

1.2藥品試劑

斷血流藥材，柳州市桂中大藥房采購；醉魚草皂苷IVb對照品，中國食品藥品檢定研究所(批號：110782-200602，含量以99.5%計)；甲醇為色譜純；超純去離子水；食用酒精。

2 指標成分含量測定方法

2.1對照品溶液制備

稱取醉魚草皂苷Ⅳb對照品0.0050g，精確至0.0001g，置于100mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻并使之溶解。此溶液濃度為50μg/mL，置于2～4℃保存。

2.2色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱，5μm，250×4.6mm；流動相：甲醇-水，0min～5min，70%甲醇，5min～15min，70%～90%甲醇；檢測波長為250nm；流速1.0mL/min；柱溫30℃。

2.3標準曲線制備

準確移取2.1對照品溶液適量以甲醇稀釋配置標準工作系列溶液，制成濃度分別為2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL。在上述2.2的色譜條件，分別取20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積(見圖1)。以醉魚草皂苷Ⅳb的濃度為X軸，其相應的峰面積為Y軸，繪制標準工作曲線。結果表明：醉魚草皂苷Ⅳb在2.5μg/mL～20μg/mL范圍內線性良好，回歸方程為：Y=30.6701X+1.9054，r=0.9999。

圖1 醉魚草皂苷Ⅳb對照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

2.4樣品指標成分含量測定

將斷血流藥材按各工藝條件提取，最后濃縮制備成1∶1的斷血流提取液(一份干藥材制成一份提取物)。精密稱取0.1g提取液置于10mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻后，用0.45μm濾膜過濾，濾液作為待測樣品溶液。在上述2.2的色譜條件，精密量取20μL注入高效液相色譜儀(樣品色譜圖如圖2所示)，記錄峰面積, 用回歸方程計算樣品制備成分醉魚草皂苷Ⅳb含量即得。

3 試驗方法與結果

3.1提取階段-單因素考察

3.1.1提取溶劑及濃度

在考慮實際生產及產品應用的基礎上，選取水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇為提取溶劑，溶劑用量10倍，分別采用加熱回流提取1h。按2.4項下方法制備樣品溶液，并進行測定，結果如表1所示。由結果可知,用30%乙醇與50%乙醇提取及75%乙醇、與95%乙醇提取，其指標成分含量接近，表明在30%乙醇至50%乙醇之間及在75%乙醇至95%乙醇之間其指標成分提取率差別不大。綜合考慮成本，故選取水、30%乙醇、75%乙醇作為正交試驗水平。

表1 不同提取劑濃度對斷血流提取物指標成分影響

3.1.2料液比

稱取100g藥材5份，分別按料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14加入75%乙醇溶液，加熱回流提取2次，每次時間2h，按2.4項下方法制備樣品溶液，并進行測定，結果如表2所示。結果顯示，醉魚草皂苷Ⅳb隨著提取溶劑用量的增大而增加，提取越完全。綜合成本考慮，故選用料液比1∶8、1∶10、1∶12作為正交試驗水平。

表2 不同料液比對斷血流提取物指標成分影響

3.1.3提取時間

稱取100g藥材5份，加入10倍量75%乙醇溶液，加熱回流提取2次，提取時間分別按0.5、1.0、1.5、2.0、3.0h，按2.4項下方法制備樣品溶液，并進行測定，結果如表3所示。結果顯示，醉魚草皂苷Ⅳb隨著提取時間的增大而增加，1.5h后逐漸趨于平穩(wěn)。綜合成本考慮，故選用提取時間1.0、1.5、2.0h作為正交試驗水平。

表3 不同提取時間對斷血流提取物指標成分影響

3.1.4提取次數(shù)

稱取100g藥材5份，加入10倍量75%乙醇溶液加熱回流提取1、2、3、4、5次，每次提取時間為1h，按2.4項下方法制備樣品溶液，并進行測定，結果如表4所示。結果顯示，醉魚草皂苷Ⅳb隨著提取次數(shù)的增加提取越完全，2次后逐漸趨于平穩(wěn)。綜合成本考慮，故選用提取次數(shù)1、2、3次作為正交試驗水平。

表4 不同提取次數(shù)對斷血流提取物指標成分影響

3.2提取階段-正交試驗優(yōu)選提取工藝

3.2.1正交設計

在單因素實驗的基礎上，以指標成分醉魚草皂苷Ⅳb的提取率為評價指標，考察提取溶劑濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取次數(shù)(D)對提取工藝的影響。按 L9(34)正交表分別進行加熱回流提取，按2.4項下方法制備樣品溶液，并進行測定。正交試驗因素水平見表5，結果見表6。

表5 實驗因素水平表

表6 正交試驗條件及結果

3.2.2正交試驗結果分析

采用直觀分析，從表6中的極差計算結果可以看到，影響因素順序依次為 A>B>C>D，溶劑濃度(A)為主要因素，且A3>A1>A2，故選其最優(yōu)水平A3；料液比(B)為次要因素，且B3>B2>B1,故選其最優(yōu)水平B3；提取時間(C)C3>C2>C1，故選擇提取時間C3；提取次數(shù)(D)極差較小，從極差分析D2優(yōu)于D1與D3，故選擇提取次數(shù)D2。因此最佳提取工藝為A3B3C3D2，即以斷血流藥材12倍量的75%乙醇加熱回流提取2次，每次2.0h。

3.2.3驗證試驗

稱取3份斷血流藥材，每份100g，依據正交試驗結果的最佳提取工藝，平行實驗3次，測定提取液中指標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量。結果分別為668μg·g-1、689μg·g-1、697μg·g-1。由此可知，在最佳試驗工藝條件下，提取物指標成分含量相近，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3.3濃縮階段

以上述確定的最佳提取工藝條件對斷血流進行提取，得到的提取液作為下述試驗的樣品。

3.3.1濃縮方式

在預試驗基礎上，采用常壓加熱濃縮和減壓加熱濃縮(-0.08～-0.09MP)兩種濃縮方式，以提取物指標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量為依據，在60℃下濃縮2h，并進行三組平行實驗。按2.2項下色譜條件進行測定，結果如下表7所示。結果顯示，采用常壓加熱濃縮方式斷血流提取物中醉魚草皂苷Ⅳb含量較減壓加熱濃縮高23%左右；說明在同樣的條件下，常壓加熱濃縮更有利于斷血流指標成分留存。故選擇常壓加熱濃縮方式。

表7 不同濃縮方式對斷血流提取物指標成分影響

3.3.2濃縮溫度

采用常壓加熱濃縮，分別控制濃縮溫度在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下，濃縮時間為2h；濃縮結束后按濃縮液的量換算成1∶1的提取物測定指標成分含量。按2.2項下色譜條件進行測定，結果如下表8所示。結果顯示，隨著濃縮溫度的升高，斷血流提取物中醉魚草皂苷Ⅳb含量也隨之提高，溫度提高到90℃后，含量提高趨勢趨于平緩。因此，將濃縮溫度控制在90℃較為合適。在提取液提取工藝條件相同的條件下，提取液中醉魚草皂苷Ⅳb含量應恒定在一定量，但卻出現(xiàn)隨著濃縮溫度上升醉魚草皂苷Ⅳb含量增加的情況，說明斷血流提取液中存在其他與醉魚草皂苷Ⅳb結構相似的物質，在高溫下轉變?yōu)樽眙~草皂苷Ⅳb，使其含量提高。

表8 不同濃縮溫度對斷血流提取物指標成分影響

3.3.3濃縮時間

采用常壓加熱濃縮，分別控制濃縮時間為1h、2h、3h、4h、5h下，濃縮溫度為100℃；濃縮結束后按濃縮液的量換算成1∶1的提取物測定指標成分含量。按2.2項下色譜條件進行測定，結果如下表9所示。結果顯示，斷血流提取物中醉魚草皂苷Ⅳb含量隨著濃縮時間的增大而提高，濃縮時間到4小時后，含量趨于平穩(wěn)。因此，綜合考慮生產效率幾能耗，將濃縮時間控制在4h較為合適。在提取液提取工藝條件相同的條件下，提取液中醉魚草皂苷Ⅳb含量應恒定在一定量，但卻出現(xiàn)隨著濃縮時間上升醉魚草皂苷Ⅳb含量增加的情況，與隨濃縮溫度提高其含量也隨之提高一樣，說明斷血流提取液中存在其他與醉魚草皂苷Ⅳb結構相似的物質，濃縮時間延長提高了轉化率，從而使醉魚草皂苷Ⅳb含量隨之提高。

表9 不同濃縮時間對斷血流提取物指標成分影響

3.3.4驗證試驗

取在最佳提取工藝條件下提取的斷血流提取液3份，采用常壓加熱濃縮進行3次平行試驗，控制濃縮時間為4h，濃縮溫度為90℃，最后將濃縮液調成1∶1的提取物；測定提取物中指標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量。結果分別為1702μg·g-1、1657μg·g-1、1715μg·g-1。由此可知，在采用常壓加熱濃縮，濃縮時間為4h，濃縮溫度為90℃時，提取物指標成分含量較高且相近，表明該濃縮工藝穩(wěn)定可行。

3.4工藝對比試驗

將本文研究得出的最佳提高斷血流提取物指標成分提取濃縮工藝(A∶75%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶12、加熱回流提取2次，每次2h；提取液采用常壓加熱濃縮，濃縮溫度為90℃，濃縮時間為4h。)與其它研究工藝(B：75%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶10、加熱回流提取2次，每次2.5h；提取液采用減壓加熱濃縮(-0.08～-0.09MP)，濃縮溫度為60℃，濃縮時間為3h。)對比。

取斷血流藥材6份，每份100g，按上述兩種工藝方法進行3次平行試驗，結果如表10所示，采用工藝方法A制備斷血流提取物，其指標成分較工藝方法B提高了3倍。結果表明，本文研究的斷血流提取濃縮工藝，能顯著的提高其指標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量。

表10 工藝對比試驗結果

4 結論

本研究優(yōu)化了中藥斷血流提取物的制備工藝，以提高其指標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量為主要目的。對制備工藝的提取階段和濃縮階段進行了考察，采用正交試驗優(yōu)化了提取階段的最佳工藝：75%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶12、加熱回流提取2次，每次2h；并對濃縮階段的濃縮方式選擇及其影響因素分別進行了試驗，得出了最佳濃縮工藝方法：采用常壓加熱濃縮，濃縮溫度為90℃，濃縮時間為4h；最后通過工藝對比試驗驗證，結果表明，本文研究的斷血流提取濃縮工藝，能顯著的提高其指標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量，較對比工藝含量提高了3倍，該工藝穩(wěn)定可行，適應大生產要求。但斷血流提取物其標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量在濃縮階段隨濃縮條件變化而顯著變化的原因，還有待進一步深入研究。