帕瑞昔布鈉對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角膠質(zhì)纖維酸性蛋白及脊髓炎性反應(yīng)的影響

劉少星，謝先豐，曹德鈞

（成都市第二人民醫(yī)院麻醉科，四川成都 610017）

神經(jīng)病理性疼痛是以痛覺過敏、自發(fā)性疼痛為特征的疼痛類型，神經(jīng)免疫系統(tǒng)紊亂、炎癥介質(zhì)異常分泌所引起的外周敏化和中樞敏化是造成神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，該過程也被稱為“神經(jīng)源性炎癥”[1]。脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞在外周神經(jīng)損傷過程中過度活化并釋放炎性細(xì)胞因子是病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中重要的因素之一，而環(huán)氧合酶-2（COX-2）作為介導(dǎo)神經(jīng)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵酶參與神經(jīng)病理性疼痛的重要發(fā)生發(fā)展過程[2-3]。帕瑞昔布鈉是一種靜脈用高選擇性COX-2抑制劑，廣泛應(yīng)用于手術(shù)患者的超前鎮(zhèn)痛和術(shù)后疼痛治療。本研究擬建立大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎的經(jīng)典神經(jīng)病理性疼痛模型（CCI），觀察帕瑞昔布鈉靜脈注射對大鼠熱痛閾、機(jī)械痛閾及脊髓背角膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP）表達(dá)、脊髓中COX-2 及脊髓炎性細(xì)胞因子IL-1β 及TNF-α 含量的影響，探討帕瑞昔布鈉靜脈給藥對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的影響及機(jī)制，為帕瑞昔布鈉在神經(jīng)病理性疼痛方面的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物選擇及分組

健康成年雄性SD 大鼠42 只，體重250～300 g，8～10 周齡，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)麻醉與危重病實(shí)驗(yàn)中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組（n＝14）：假手術(shù)組（S 組）、神經(jīng)病理性痛組（CCI 組）、帕瑞昔布鈉組（P 組）。

1.2 大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型制備

參照文獻(xiàn)[4]，采用坐骨神經(jīng)慢性結(jié)扎損傷法（CCI）制作大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg 麻醉，待翻正反射消失后，俯臥位固定，右后肢備皮消毒，于大腿中部外緣切開皮膚，鈍性分離肌肉，游離坐骨神經(jīng)主干長約7 mm，用4-0 鉻制腸線于坐骨神經(jīng)主干分別結(jié)扎4 道結(jié)扎環(huán)，環(huán)間間隔約1 mm，結(jié)扎強(qiáng)度以引起小腿肌肉輕度顛動為宜，絲線逐層縫合肌肉及皮膚；S 組僅游離出坐骨神經(jīng)主干不結(jié)扎，P 組在皮膚縫合結(jié)束后即刻經(jīng)鼠尾靜脈注射帕瑞昔布鈉10 mg/kg（批號85820004，Pfizer 公司，美國），連續(xù)3 d。術(shù)畢將大鼠放入鼠籠，于溫暖、安靜環(huán)境自由單籠喂養(yǎng)。S 組、CCI 組在相同時點(diǎn)經(jīng)尾靜脈注射等容量的生理鹽水。模型制備由同一人完成，術(shù)中烤燈照射維持直腸溫度約37℃。

1.3 機(jī)械痛閾和熱痛閾的測定

分別于術(shù)前1 d、術(shù)后4 d、7 d、14 d 時測定機(jī)械痛閾和熱痛閾。機(jī)械痛閾測定:在安靜的環(huán)境中，將大鼠置于金屬網(wǎng)格籠子中，待大鼠安靜且足底伸展適中后，用Electronic von Frey 觸覺測痛儀（2392 型）垂直刺激大鼠右足底中部并記錄大鼠出現(xiàn)抬足、躲避、舔足等動作時的刺激力度；每只大鼠重復(fù)測量5 次，每次間隔大于10 s，取平均值作為機(jī)械痛閾。熱痛閾測定：在安靜的環(huán)境中，將大鼠放入厚度為6 mm 的透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)，待大鼠安靜且足底伸展適中后。用Series8 型熱測痛儀照射大鼠右后足底中部，待大鼠產(chǎn)生快速縮足、揚(yáng)足或舔足后停止照射，記錄照射時間；每只大鼠重復(fù)測量5 次，每次測量間隔5 min。取平均值作為熱痛閾。

1.4 脊髓背角膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達(dá)的測定

于術(shù)后14 d 在測定機(jī)械痛閾和熱痛閾后1 h，各組隨機(jī)取7 只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg 麻醉，斷頭處死大鼠，于冰皿上分離取L4-6脊髓節(jié)段置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 后石蠟包埋、切片，組織切片脫蠟脫水，免疫組化SP 法檢測GFAP，DAB 顯色，免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于武漢博士德生物技術(shù)公司。由另一觀察者在不知分組情況下每只動物選取5 張切片在400 倍視野下隨機(jī)選取右側(cè)脊髓背角內(nèi)不重疊的5 個視野，計(jì)數(shù)視野中GFAP 陽性細(xì)胞數(shù)，以平均值表示GFAP 表達(dá)值。

1.5 脊髓COX-2、IL-1β、TNF-α 含量的測定

各組中剩余7 只大鼠麻醉，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg 麻醉，處死大鼠，于冰皿上分離取L4-6 脊髓節(jié)段，稱重后按1:9 比例加入冷PBS液，制成10%脊髓組織勻漿，4℃下3 000 r/min 離心20 min 收集上清液。采用ELISA 法測定COX-2、IL-1β 及TNF-α 含量，嚴(yán)格按照試劑盒（R&D 公司，美國）說明書要求進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熱痛閾、機(jī)械痛閾的改變

術(shù)前1 d 時各組大鼠熱痛閾、機(jī)械痛閾無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）；與S 組比較，CCI 組和P 組術(shù)后4 d、7 d、14 d 時熱痛閾、機(jī)械痛閾明顯降低（P＜0.05），與CCI 組比較，P 組術(shù)后4 d、7 d、14 d 時熱痛閾、機(jī)械痛閾明顯升高（P＜0.05）見表1。

2.2 脊髓背角GFAP 及脊髓中COX-2、IL-1β、TNF-α 的改變

S 組大鼠術(shù)后14d 時右側(cè)脊髓背角GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)少，形態(tài)正常，分支少；與S 組比較，CCI 組大鼠術(shù)后14d 右側(cè)脊髓背角GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯增多（P＜0.05），體積增大，分支增多，較多突起斷裂，脊髓中COX-2、IL-1β 及TNF-α 含量升高（P＜0.05）。與CCI 組比較，P組大鼠術(shù)后14d 右側(cè)脊髓背角GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯減少（P＜0.05），體積減小，突起及分支減少，脊髓中COX-2、IL-1β 及TNF-α 含量降低（P＜0.05），見表2、圖1。

表1 4 組大鼠不同時點(diǎn)痛閾的比較［n=14，（）］Tab.1 Comparison of pain threshold at different time points among the 3 groups ［n=14，（）］

表1 4 組大鼠不同時點(diǎn)痛閾的比較［n=14，（）］Tab.1 Comparison of pain threshold at different time points among the 3 groups ［n=14，（）］

與S 組比較，*P＜0.05；與CCI 組比較，▲P＜0.05；與術(shù)前1 d 比較，＃P＜0.05。

表2 術(shù)后14 d 各組大鼠脊髓GFAP、COX-2、IL-1β 及TNF-α 的比較［n=7，（）］Tab.2 Comparison of GFAP，COX-2，IL-1β and TNF-α in the spinal cord of rats in each group at 14 days after operation ［n=7，（）］

表2 術(shù)后14 d 各組大鼠脊髓GFAP、COX-2、IL-1β 及TNF-α 的比較［n=7，（）］Tab.2 Comparison of GFAP，COX-2，IL-1β and TNF-α in the spinal cord of rats in each group at 14 days after operation ［n=7，（）］

與S 組比較，*P＜0.05；與CCI 組比較，▲P＜0.05。

圖1 術(shù)后14 d 時各組大鼠脊髓背角GFAP 對比（×40）Fig.1 Comparison of GFAP in rats spinal dorsal horn in each group at 14 days after operation（×40）

3 討論

本研究參考文獻(xiàn)[4]采用結(jié)扎坐骨神經(jīng)干的方法制備大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型。本研究結(jié)果表明，CCI 組和P 組大鼠在術(shù)后均出現(xiàn)右后爪內(nèi)收畸形，后肢保護(hù)等表現(xiàn)；與S 組比較，CCI 組和P 組大鼠在術(shù)后各時術(shù)后4 d、7 d、14 d 均出現(xiàn)熱痛閾、機(jī)械痛閾明顯降低，提示模型制備成功。

本研究參照文獻(xiàn)[5]采用經(jīng)鼠尾靜脈注射帕瑞昔布鈉劑量10 mg/kg，結(jié)合臨床使用帕瑞昔布鈉用于術(shù)后鎮(zhèn)痛用藥時間通常不超過3 d，選擇術(shù)后連續(xù)3 d，并于術(shù)后第4 天、7 天、14 天檢查各指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與CCI 組比較，P 組術(shù)后4 d、7 d、14 d 機(jī)械痛閾和熱痛閾升高，提示帕瑞昔布鈉10 mg/kg 靜脈注射可減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的膠質(zhì)細(xì)胞系成員，主要為神經(jīng)細(xì)胞提供營養(yǎng)和支撐，并具有調(diào)節(jié)離子平衡和神經(jīng)遞質(zhì)、維持血腦屏障穩(wěn)定等重要作用[6，7]。周圍神經(jīng)及腰脊神經(jīng)結(jié)扎、脊髓創(chuàng)傷等可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞激活而進(jìn)入活化狀態(tài)，發(fā)生增生、肥大并進(jìn)入增殖狀態(tài)，形成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生；過度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌活性氧、前列腺素、氧化亞氮、神經(jīng)生長因子等神經(jīng)活性物質(zhì)及多種炎性因子，使神經(jīng)細(xì)胞處于敏化狀態(tài)[8]。GFAP 是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性蛋白和骨架標(biāo)記物，是星形膠質(zhì)細(xì)胞成熟的標(biāo)志[9]。Liu 等[10]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)病理性痛大鼠模型制備成功后24～48 h，外周神經(jīng)結(jié)扎側(cè)脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞開始被激活，GFAP 表達(dá)增加，第14 天時最明顯且其激活程度與觸誘發(fā)痛正相關(guān)，因此本研究在模型制備后14 d 檢測脊髓中GFAP、COX-2 和炎癥因子TNF-α、IL-1β 含量。在大鼠CCI 模型中，外周神經(jīng)損傷后脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活后發(fā)生細(xì)胞形態(tài)、功能改變，星形膠質(zhì)細(xì)胞突觸后的樹突中COX-2mRNA 與蛋白水平迅速升高，釋放神經(jīng)毒性物質(zhì)如IL-1β、TNF-α、IL-6、氧自由基、谷氨酸、P 物質(zhì)等參與中樞敏化引發(fā)疼痛[11-13]。過度表達(dá)的炎癥因子TNF-α、IL-β 又可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[14-16]。抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞功能可以明顯減輕痛覺過敏現(xiàn)象[17-18]。COX-2 是花生四烯酸代謝途徑限速酶之一，有研究表明TNF-α、IL-β 可通過環(huán)氧合酶通路參與脊髓水平的傷害信息的傳遞和加工使脊髓中傷害感受過程易化，促進(jìn)炎性反應(yīng)，參與中樞敏化[19-20]。本研究結(jié)果表明，S 組術(shù)后14 d 時大鼠脊髓背角GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)少，形態(tài)正常，分支少；與S 組比較，CCI 組術(shù)后14d 時GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯增多，體積增大，分支增多，可見較多突起斷裂，脊髓中COX-2、IL-1β 及TNF-α含量升高；與CCI 組比較：P 組術(shù)后14d 時GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯減少，體積減小，突起及分支減少，脊髓中COX-2、IL-1β 及TNF-α 含量降低。提示帕瑞昔布鈉10mg/kg 靜脈注射減輕神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制與抑制脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化釋放COX-2，抑制炎癥細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α 表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，帕瑞昔布鈉靜脈注射可通過抑制脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，降低脊髓中COX-2、IL-1β 及TNF-α 含量，減輕脊髓炎性反應(yīng)，減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛。