黑皮雞菌固體培養(yǎng)基及溫度優(yōu)化*

王 皓，劉 迪，2**，李官浩，陳功鑫，于婷婷，金香花

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉133002；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食（藥） 用真菌研究所，吉林延吉133002；3.延邊大學(xué)食品研究中心，吉林延吉133002；4.延邊百草藥材有限公司，吉林琿春133300）

1 材料與方法

1.1 供試品種

1.2 試驗設(shè)備

HF-150A型數(shù)控電熱恒溫培養(yǎng)箱，金壇市恒豐儀器廠；GD-2-500型電熱鼓風干燥箱，湖北黃石市醫(yī)療器械廠；HVA-85高壓滅菌器，株式會社平山制作所；JL102N型電子天平，上海精天電子儀器有限公司；YD-C2試驗臺，遼寧育達科技裝備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基配方

碳源基本培養(yǎng)基：酵母浸膏2 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、MgSO41 g、瓊脂 20 g·L-1；氮源基本培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、MgSO41 g、瓊脂20 g·L-1；無機鹽基本培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、酵母浸膏 2 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1。

1.4 單因素試驗

1.4.1 碳源的影響

碳源水平設(shè)置有乳糖、果糖、甘露醇、淀粉、葡萄糖、麥芽糖以及蔗糖。將碳源基本培養(yǎng)基設(shè)為對照組。碳源含量為20 g·L-1，氮源含量為2 g·L-1，無機鹽含量為0.5 g·L-1。將大小為0.5 mm左右長勢良好的黑皮雞菌菌塊用打孔器接種于平板中央，并于恒溫箱中進行暗培養(yǎng)，每組5個重復(fù)。在坐標紙上記錄菌落日均長勢，選擇其中長勢較好的培養(yǎng)皿，觀察其菌落生長速度、菌落長、干重和整齊邊緣的特征，菌絲長滿后，使用十字交叉法測定菌落直徑，做好記錄。黑皮雞菌菌絲日均生長速率按參考文獻[16]進行計算。

1.4.2 氮源的影響

氮源水平設(shè)置有蛋白胨、酪蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、牛肉膏、硝酸銨、酵母浸膏和硝酸鈉。將氮源基本培養(yǎng)基設(shè)為對照組。碳源的含量為20 g·L-1，氮源的含量為 2 g·L-1，無機鹽的含量為 0.5 g·L-1，每組5個重復(fù)。

1.4.3 無機鹽的影響

無機鹽水平設(shè)置有硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鉀、硫酸錳、碳酸鈣以及硫酸鋅。將無機鹽基本培養(yǎng)基設(shè)為對照組。碳源的含量為20 g·L-1，氮源的含量為2 g·L-1，無機鹽的含量為0.5 g·L-1，每組5個重復(fù)。

1.5 正交試驗設(shè)計

表1 正交試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

如表 1 所示，設(shè)置碳源水平為15 g·L-1、20 g·L-1、25 g·L-1；氮源水平為 2.0 g·L-1、2.5 g·L-1、3.0 g·L-1；無機鹽水平為0.3 g·L-1、0.5 g·L-1、0.7 g·L-1；瓊脂20 g·L-1，水 1 000 mL。

1.6 溫度試驗設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對黑皮雞菌菌絲生長的影響

表2 不同碳源對黑皮雞菌菌絲體生長的影響Tab.2 Effects of different carbon source formulas on Oudemansiella radicata mycelial growth

表2 不同碳源對黑皮雞菌菌絲體生長的影響Tab.2 Effects of different carbon source formulas on Oudemansiella radicata mycelial growth

注：“+”表示菌絲的生長勢，隨著“+”增多，表示菌絲長勢越濃密、越粗壯；不同小寫字母表示P<0.05水平上的差異顯著性。數(shù)據(jù)為5個重復(fù)的平均值±SE。Note:“+” means the growth potential of hyphae.With the increase of“+”,it means the denser and better growth potential of hyphae.The lowercase letters indicate the significant difference at the level of P<0.05.The data were 5 repetitive averages±SE.

碳源 菌絲干重/mg日均生長速度/（mm·d-1）菌絲長勢邊緣整齊度對照（CK） 0.009 1d 0.369 7a ++ 整齊淀粉 0.042 2bc 0.038 2c +++ 整齊葡萄糖 0.040 1bc 0.375 0a +++ 整齊蔗糖 0.031 0bcd 0.374 3a +++ 整齊乳糖 0.048 4b 0.344 0b +++ 整齊甘露醇 0.022 7cd 0.376 7a +++ 整齊麥芽糖 0.030 2bcd 0.369 7a +++ 整齊果糖 0.071 5a 0.356 7ab +++ 整齊

由表2可知，在以果糖為碳源時，菌絲生長勢最優(yōu)、最為濃厚、生長速度最快，且菌絲干重最大，為0.071 5 mg。因此，適合于黑皮雞菌菌絲體生長發(fā)育的最佳碳源為果糖，其次為乳糖。

2.2 不同氮源對黑皮雞菌絲體生長的影響

表3 不同氮源對黑皮雞菌菌絲體生長的影響Tab.3 Effects of different nitrogen source formulas on Oudemansiella radicata mycelia growth

表3 不同氮源對黑皮雞菌菌絲體生長的影響Tab.3 Effects of different nitrogen source formulas on Oudemansiella radicata mycelia growth

注：“+”表示菌絲的生長勢，隨著“+”增多，表示菌絲長勢越濃密、越粗壯；小寫字母表示P<0.05水平上的差異顯著性。數(shù)據(jù)為5個重復(fù)的平均值±SE。Note：“+” means the growth potential of hyphae.With the increase of“+”,it means the denser and better growth potential of hyphae.The lower-case letters indicate the significant difference at the level of P<0.05.The data were 5 repetitive averages±SE.

氮源 菌絲干重/mg日均生長速度/（mm·d-1）菌絲長勢邊緣整齊度對照（CK） 0.002 0f 0.254 0ab ++ 整齊酵母浸膏 0.070 6a 0.259 7ab +++ 整齊酪蛋白胨 0.038 4b 0.273 3a +++ 整齊氯化銨 0.015 4de 0.221 0c ++ 整齊蛋白胨 0.024 9c 0.271 0a +++ 整齊牛肉膏 0.028 2c 0.276 7a +++ 整齊硫酸銨 0.023 3cd 0.232 3bc ++ 整齊硝酸銨 0.010 5de 0.205 0c ++ 整齊硝酸鈉 0.023 5cd 0.255 0ab ++ 整齊

如表3所示，以酵母浸膏為氮源時，菌絲生長勢最優(yōu)且干重最大，為0.070 6 mg，明顯高于其余處理。綜上所述，酵母浸膏為黑皮雞菌菌絲體生長的最佳氮源，其次為酪蛋白胨。

2.3 不同無機鹽對黑皮雞菌菌絲體生長的影響

如表4所示，以硫酸鉀為無機鹽時，菌絲體生長速度及生長勢最好，菌絲體粗壯，菌絲邊緣整齊，干重最大，為0.031 2 mg，而以硫酸鋅為無機鹽時菌絲幾乎不生長。綜上所述，硫酸鉀為黑皮雞菌菌絲體生長的最佳無機鹽。

2.4 正交試驗

正交試驗中極差越大表明此因素對試驗結(jié)果影響越大。L（93）3正交試驗結(jié)果與極差分析見表5。

表4 不同無機鹽對黑皮雞菌菌絲體生長的影響Tab.4 Effects of different inorganic formulas on Oudemansiella radicata growth mycelia

表4 不同無機鹽對黑皮雞菌菌絲體生長的影響Tab.4 Effects of different inorganic formulas on Oudemansiella radicata growth mycelia

注：“+”表示菌絲的生長勢，隨著“+”增多，表示菌絲長勢越濃密、越粗壯；小寫字母表示P<0.05水平上的差異顯著性。數(shù)據(jù)為5個重復(fù)的平均值±SE。Note：“+” means the growth potential of hyphae.With the increase of“+”,it means the denser and better growth potential of hyphae.The lowercase letters indicate the significant difference at the level of P<0.05.The data were 5 repetitive averages±SE.

無機鹽 菌絲干重/mg日均生長速度/（mm·d-1）菌絲長勢邊緣整齊度(CK) 0.030 5a 0.191 3a ++ 整齊硫酸鎂 0.028 8a 0.194 7a ++ 整齊硫酸鈣 0.028 2a 0.184 3a ++ 整齊硫酸錳 0.025 7a 0.191 3a ++ 整齊硫酸鋅 0.002 4b 0.010 7b + 整齊硫酸鉀 0.031 2a 0.187 0a ++ 整齊氯化鈉 0.027 7a 0.185 7a ++ 整齊

表5 L9（33）正交試驗結(jié)果Tab.5 Results of L9(33)orthogonal test

由表5可知，A、B、C三個因素的極差值R分別為0.006 3、0.013 1、0.009 5，所以影響菌絲體干重的因素依次為最佳氮源濃度＞最佳無機鹽濃度＞最佳果糖濃度；A3B3C3是黑皮雞菌菌絲生長和發(fā)育的最佳組合。

2.5 不同溫度對菌絲生長影響

不同溫度對菌絲生長的影響結(jié)果見表6。

表6 不同溫度對黑皮雞菌菌絲體生長的影響Tab.6 Effects of different temperature on Oudemansiella radicata mycelia growth

表6 不同溫度對黑皮雞菌菌絲體生長的影響Tab.6 Effects of different temperature on Oudemansiella radicata mycelia growth

注：“+”表示菌絲的生長勢，隨著“+”增多，表示菌絲長勢越濃密、越粗壯；“-”代表菌絲不生長。Note:“+” means the growth potential of hyphae.With the increase of“+”,it means the denser and better growth potential of hyphae.“+” means that the mycelia didn’t grow.

溫度/℃菌絲干重/mg日均生長速度/（mm·d-1）菌絲長勢邊緣整齊度35 0d 0d - -17 0.006 9c 0.311 0b +++ 整齊20 0.012 4b 0.344 1ab +++ 整齊25 0.025 7a 0.375 0a ++ 整齊28 0.011 0b 0.290 4bc ++ 整齊30 0.010 0bc 0.246 0bc +++ 整齊32 0.000 8d 0.036 4d +++ 整齊

3 結(jié)論

通過單因素分析明確了影響菌絲干重的3個因素水平，即黑皮雞菌菌絲生長的最佳碳源、氮源、無機鹽分別為果糖、酵母浸膏、硫酸鉀。張兵等[16]研究表明碳源對黑皮雞菌菌絲生長有著很大影響，而氮源和維生素的含量對其沒有多大影響，作者將文章中出現(xiàn)這樣結(jié)果的原因歸結(jié)為碳源在培養(yǎng)基中占很大的比例，而氮源和生長因子所占成分較小，所以影響不大。呂英華等[17]對野生桑黃固體培養(yǎng)基優(yōu)化中得出氮源是影響最大的。所以，本次試驗結(jié)果中得出氮源是對其菌絲生長影響最大的結(jié)論，可能由于地區(qū)原因以及品種原因，在延邊地區(qū)，對黑皮雞菌菌絲生長促進作用最大的是酵母浸膏。對于不同品種在延邊地區(qū)生長的最適條件中氮源是否一直是影響最大的因素還有待進一步研究。