MALDI-TOFMS在藥物基因組學(xué)檢測中的應(yīng)用及展望

曹書娟 劉彬 朱安娜

藥物基因組學(xué)是近年來由藥物遺傳學(xué)發(fā)展而來的臨床基因檢測新興領(lǐng)域，其研究目的是闡明基因多態(tài)性對藥物效應(yīng)和毒性的影響以及對藥物作用靶點的確定。不同個體的藥物遺傳多態(tài)性是藥物基因組學(xué)的基礎(chǔ)，表現(xiàn)為藥物代謝酶的多態(tài)性、藥物受體的多態(tài)性以及藥物靶標(biāo)的多態(tài)性等。在藥物代謝相關(guān)途徑中的細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450proteins，CYP）酶系是最主要的藥物代謝酶，目前已發(fā)現(xiàn)的CYP基因至少有53個，其中的CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP1A2、CYP2E的編碼基因具有較為顯著的遺傳多態(tài)性意義[1]。在藥物受體基因多態(tài)性的研究中最為重要的藥物受體是G蛋白偶聯(lián)受體，目前研究較多的是β2-腎上腺素受體[2]，另外5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）載體[3]、維生素D受體（Vitamin D receptor，VDR）[4]和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶等基因多態(tài)性[5]對藥物的作用也密切相關(guān)。藥物轉(zhuǎn)運基因及相關(guān)疾病通路基因如ApoE基因[6]、編碼P-糖蛋白的基因[7]、VKORC1基因的多態(tài)性研究[8]也證實了藥物轉(zhuǎn)運基因和疾病通路上的靶點基因與藥效之間的密切關(guān)系。藥物基因組信息是當(dāng)前個體化精準(zhǔn)醫(yī)療的一個重要部分，藥物基因組學(xué)的臨床實施可以實現(xiàn)個性化醫(yī)學(xué)，提高治療的功效，安全性和成本效益。另一方面，通過區(qū)分有效適用人群，使得更多的新藥能夠有效通過臨床試驗，為治療提供更多可能。

隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展，目前已有多種分子檢測平臺可應(yīng)用于藥物基因組學(xué)的研究，包括基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)的熒光定量PCR[9]、突變擴增阻滯系統(tǒng)熒光定量PCR[10]、微滴式數(shù)字PCR[11]、生物芯片技術(shù)[12]、Sanger測序技術(shù)[13]和二代測序技術(shù)[14]等。這些技術(shù)各具特點，也各有局限性。基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOFMS）技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展克服了PCR技術(shù)多重擴增能力不足的問題，解決了藥物基因組檢測中多個變異位點同時檢測的需求；其不依賴于熒光探針和熒光類試劑的檢測流程，質(zhì)譜技術(shù)的高準(zhǔn)確性和高靈敏度保證了檢測的高準(zhǔn)確度和重復(fù)性；同時其檢測成本相比二代測序技術(shù)具備更高的性價比。

越來越多的研究者在MALDI-TOFMS技術(shù)平臺上取得了大量的研究成果，MALDI-TOFMS已經(jīng)成為分子檢測的又一有力工具。本文將系統(tǒng)性的介紹MALDI-TOFMS技術(shù)原理和使用該技術(shù)開展的藥物基因組相關(guān)的研究進展。

1 MALDI-TOFMS技術(shù)原理

MALDI-TOFMS出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，該技術(shù)突破了傳統(tǒng)質(zhì)譜僅可以進行小分子物質(zhì)分析的局限，使得核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子也可以應(yīng)用質(zhì)譜進行研究[15]，極大推進了基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，為生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來革命性突破。

圖1 MALDI-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)原理圖示（繪制）Figure1 Schematic representation of the MALDI-TOF mass spectrometry system

質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是通過將待測樣品離子化，產(chǎn)生一系列不同質(zhì)荷比的離子，質(zhì)量分析器能夠測定該樣品中不同種類離子的分子量，按照從小到大的順序依次排列從而得到一張分子量峰圖。質(zhì)譜儀器可以通過樣品進樣方式、離子源、質(zhì)量分析器的類型等方面進行分類。其中，MALDI-TOF MS采用的是樣品與基質(zhì)混合進樣，激光解吸附電離作為離子源以及飛行時間法進行質(zhì)量分析。

首先，MALDI-TOFMS的電離過程需要基質(zhì)參與?；|(zhì)多采用有機酸[16]，因其具有很強的激光能量吸收能力，能夠增強樣品對激光的吸收，同時降低激光對樣品的破壞，對樣品起到保護作用。樣品與基質(zhì)混合后發(fā)生共結(jié)晶，經(jīng)激光照射，基質(zhì)迅速蒸發(fā)，其與樣品之間的分子間作用力快速減弱，樣品分子進而得以釋放。與此同時，基質(zhì)將吸收到的激光能量傳遞至樣品分子并使其帶上正電荷。該技術(shù)靈敏度極高，僅需pmol-fmol級別的微量樣本即可進行檢測[17]。隨后，離子化的樣品分子進入飛行時間質(zhì)量分析器，通過脈沖電場對離子化的樣品進行加速，不同分子量的離子在真空飛行管內(nèi)以各自不同的恒定速度向離子檢測器飛行，從而可以區(qū)分出樣品中不同分子量的離子（圖1）。在核酸檢測的應(yīng)用中，分子量的檢測范圍多限制在1000-10000D這個分子量區(qū)間內(nèi)[18]。在現(xiàn)有的成熟應(yīng)用中，MALDI-TOF能夠檢測的變異類型包括單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）、拷貝數(shù)變異（Copy Number Variations，CNVs）、甲基化、插入缺失突變（In/Del）等。

對于藥物基因組學(xué)檢測中常見的變異類型：SNP和CNV的檢測，MALDI-TOF主要通過基于多重PCR、單堿基延伸及質(zhì)譜檢測相結(jié)合的技術(shù)來實現(xiàn)。例如在SNP檢測中，首先通過PCR的方法將含有待測SNP的目的片段進行擴增，擴增結(jié)束后利用蝦堿性磷酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP）將體系中的剩余的dNTP去磷酸化不能夠繼續(xù)與模板結(jié)合。然后在反應(yīng)體系中繼續(xù)加入SNP多態(tài)性堿基所對應(yīng)的單堿基延伸引物（Unlined base Extension Primer，UEP）和雙脫氧核糖核苷（Dideoxynucleotide，ddNTP）等相關(guān)成分進行單堿基延伸反應(yīng)。在這個過程中，UEP可與待測SNP的5′端結(jié)合且只延伸一個堿基，根據(jù)模板中不同的SNP序列即可得到不同的延伸產(chǎn)物。經(jīng)離子交換樹脂脫去反應(yīng)體系中的Na＋、K＋、Mg2+等離子后，即可將反應(yīng)液進點樣至MALDI-TOF MS專用芯片上進行質(zhì)譜檢測并得到延伸產(chǎn)物的分子量圖譜（圖2）。

圖2 MALDI-TOFMS檢測實驗流程Figure2 MALDI-TOFMSworkflow

核酸質(zhì)譜能夠?qū)崿F(xiàn)在同一個反應(yīng)孔中對多個不同位點同時進行擴增和延伸，單孔反應(yīng)最多高達(dá)40重。因同一SNP位點上不同基因型（純和型或雜合型）對應(yīng)的堿基不同，且各個SNP位點上所設(shè)計的引物序列不同，即可在結(jié)果中以分子量圖譜的形式顯示出同一位點上的不同基因型，并區(qū)分出不同位點上的延伸產(chǎn)物峰（圖3）。同樣的原理在檢測基因突變時，在突變位點上檢出的不同堿基即為野生型和突變型。除了基因突變的定性檢測，根據(jù)質(zhì)譜圖譜中檢測峰的峰面積與該分子量核酸片段的含量成正比的關(guān)系，還能夠計算出樣本中野生型和突變型在該位點上的比例。目前MALDI-TOFMS能夠檢出最低0.1%的突變比例。

一次質(zhì)譜可以同時分析多至幾十個位點的基因分型，圖為9個位點同時檢測的結(jié)果示例[19]。

圖3 MALDI-TOFMS原始數(shù)據(jù)Figure3 MALDI-TOFMS rawdata

2 MALDI-TOFMS在藥物基因組相關(guān)分子標(biāo)記檢測中的應(yīng)用

Liu等研究者為研究相關(guān)基因位點對氯吡格雷用藥的影響，在MassARRAY核酸質(zhì)譜和焦磷酸測序兩種技術(shù)平臺上，在458位中國漢族心血管患者群體中，對CYP2C19（*2，*3，*4，*5，*17）和ABCB1C3435T基因上共6個SNP進行了基因分型檢測，并使用Sanger測序作為驗證技術(shù)。其中有6份樣本在兩種方法中呈現(xiàn)不同結(jié)果。經(jīng)Sanger測序驗證，MassARRAY平臺的檢測結(jié)果與Sanger測序結(jié)果完全一致，6個SNP的次等位基因頻率在該患者群體中分別為27.1%（CYP2C19*2），5.9%（CYP2C19*3），0%（CYP2C19*4），0%（CYP2C19*5），1.1%（CYP2C19*17），40.9%（ABCB1）。該項研究的研究者認(rèn)為MassARRAY核酸質(zhì)譜技術(shù)平臺能夠為氯吡格雷相關(guān)藥物基因組檢測提供精準(zhǔn)的檢測結(jié)果，同時相比于焦磷酸測序MassARRAY能夠?qū)崿F(xiàn)高性價比、快速出具報告和更高的檢測通量[20]。奧氮平作為二代抗精神疾病藥物，在精神分裂癥的治療中起到非常重要的作用。但不同患者對奧氮平的應(yīng)答反應(yīng)個體差異巨大。Zhou等研究者使用MALDI-TOF技術(shù)對兩個獨立的實驗組進行12個與奧氮平藥物反應(yīng)相關(guān)的SNP檢測，結(jié)果顯示其中有2個SNP在兩個實驗組中均與奧氮平的藥物應(yīng)答反應(yīng)顯著相關(guān)。并指出這2個SNP在后續(xù)臨床開展的奧氮平治療中起到重要參考作用[21]。

CYP2D6基因的CNV也是藥物基因組學(xué)研究中常見的一種多態(tài)性形式。常見的CNV檢測方法只能對CYP2D6基因的單一區(qū)域進行檢測，以確定拷貝數(shù)，而人類CYP2D6基因常為與CYP2D7假基因的雜交型基因，因此這些常規(guī)方法的單一區(qū)域檢測很可能得到不準(zhǔn)確的拷貝數(shù)或藥物代謝信息。使用MALDI-TOFMS通過對CYP2D6基因中不同區(qū)域設(shè)計多個檢測位點同時進行檢測，深度覆蓋雜交型CYP2D6基因，能夠獲得更為精準(zhǔn)的拷貝數(shù)變異信息，通過設(shè)計CNV，SNP以及In/del的檢測組合，可以實現(xiàn)對一系列藥物基因組基因位點的同時檢測，提供一套快速，經(jīng)濟，準(zhǔn)確的檢測方案。實驗數(shù)據(jù)表明MALDI-TOF質(zhì)譜能夠準(zhǔn)確進行CYP2D6基因多態(tài)性分型，是一種經(jīng)濟有效的藥物基因組檢測方案[22]。同時MassARRAY核酸質(zhì)譜技術(shù)也常常作為其他分子檢測技術(shù)的驗證標(biāo)準(zhǔn)，Liu等研究者設(shè)計了一套基于熒光定量PCR技術(shù)的含32個SNP的CYP450家族基因分型和拷貝數(shù)變異panel，并使用Mass ARRAY核酸質(zhì)譜以及數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）技術(shù)對該panel檢測結(jié)果進行驗證，結(jié)果證明核酸質(zhì)譜技術(shù)具備與ddPCR一致的靈敏度和準(zhǔn)確性[23]。美國Assurex公司針對精神類疾病用藥制定了一套基于MassARRAY核酸質(zhì)譜平臺的檢測方案，和參考方法的平行比較結(jié)果具有100%的一致性[24]，基于此Assurex使用該平臺開發(fā)的GenesightPGx檢測pane l覆蓋55種常見藥物，檢測量每年超過50萬人次。國內(nèi)的第三方檢測機構(gòu)和醫(yī)院也逐漸基于此平臺開展高血壓、精神分裂、抑郁癥等疾病用藥基因檢測。

3 展望

現(xiàn)有的可用于藥物基因組學(xué)相關(guān)研究的技術(shù)和平臺，如熒光定量PCR、微滴式數(shù)字PCR，生物芯片技術(shù)，Sanger測序技術(shù)和二代測序技術(shù)等，這些技術(shù)在實驗操作難度、檢測時間的長短、檢測成本的控制、數(shù)據(jù)分析難度等方面各有利弊。相比之下，已有大量研究證明MALDI-TOFMS利用多重PCR技術(shù)，在同一個反應(yīng)中同時檢測高達(dá)40個變異位點，不但能夠?qū)λ幬锘蚪M學(xué)中相關(guān)SNP進行檢測，還能夠在同一panel中同時檢測CNV和Indel，極大的提高了檢測效率，節(jié)約了樣本用量，同時其基于分子量的質(zhì)譜檢測方式提供了不依賴于熒光信號的檢測準(zhǔn)確度，以極高的性價比滿足了藥物基因組分子檢測的需求。美國食品藥品監(jiān)督管理局（U.S.Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）已于2018年批準(zhǔn)美國Agena Bioscience公司的MassARRAY?MALDI-TOFMS可用于臨床核酸檢測[25]。在中國，達(dá)瑞生物的DR MassARRAY飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)通過了國家藥品監(jiān)督管理 局（National Medical Products Administration，NMPA）審核，成為國內(nèi)第一臺獲批IVD核酸質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，批準(zhǔn)其SNP方面的應(yīng)用，如耳聾基因檢測等。

隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association analysis，GWAS）生物統(tǒng)計/信息平臺的建立和發(fā)展，越來越多的基因多態(tài)性信息被發(fā)現(xiàn)與藥物在體內(nèi)的代謝、轉(zhuǎn)運、和作用靶點密切關(guān)聯(lián)。自2007年FDA批準(zhǔn)了第一種遺傳分子檢測，根據(jù)CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性預(yù)測抗凝藥華法林的敏感性[26-28]，標(biāo)志著藥物基因組學(xué)已經(jīng)開始由實驗室研究走向?qū)嶋H應(yīng)用。到目前為止已有140余種藥物經(jīng)FDA批準(zhǔn)，在說明書中附上其藥物基因組信息，用于指示不同基因型的臨床患者在應(yīng)用該藥物時對療效和毒性的預(yù)測作用[28]，其中涵蓋了高血壓、內(nèi)分泌、哮喘、高血脂、精神類、腫瘤等疾病的藥物治療。在我國，為進一步推進合理用藥、安全用藥，中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會于2015年7月頒布了《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術(shù)試行指南》（國衛(wèi)醫(yī)醫(yī)護便函〔2015〕240號）[29]。在指南中明確指出藥物代謝酶和藥物作用靶點相關(guān)的藥物種類及其對應(yīng)基因，進一步提高了藥物基因組學(xué)檢測的重要性并作出規(guī)范化的要求。

基于MALDI-TOFMS的核酸檢測平臺具備了獨特的多重PCR技術(shù)，穩(wěn)定且準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，經(jīng)濟的檢測成本和快速的周轉(zhuǎn)時間，能夠滿足臨床上越來越多的對中高通量SNP、CNV及Indel變異的定性和定量檢測需求，這些優(yōu)勢也使得核酸質(zhì)譜技術(shù)在基因檢測領(lǐng)域顯示出強大的競爭力。伴隨全球?qū)λ幬锘蚪M研究日益增長的關(guān)注度和更多遺傳標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，以及對核酸質(zhì)譜技術(shù)的了解與應(yīng)用不斷深入，該檢測平臺將成為分子檢測實驗室不可或缺的標(biāo)準(zhǔn)裝備。