應用QF-PCR和CNV-seq以及染色體核型分析檢測羊水的染色體畸變及結果分析

喬金平 胡文君 陳薇 劉慧 張小鵬 代雅倩 彭麗朵 徐元宏 方慧琴★ 袁靜★

出生缺陷在我國的發(fā)生率約5.6%，而以染色體數(shù)目異常、大片段缺失或重復及致病性基因組致病性拷貝數(shù)變異（Copy Number Variation，CNV）等為主的染色體畸變約占出生缺陷的遺傳學病因的80%以上[1-2]。染色體核型分析技術（下文簡稱為核型分析），是染色體疾病確診的金標準之一，但需要細胞培養(yǎng)，存在檢測時間長、通量低、分辨率較低（無法檢出5Mb以下的CNV）等諸多不足，已無法滿足日益增長的產(chǎn)前診斷需求[2]?；诘蜕疃热蚪M測序的基因組拷貝數(shù)變異測序（Copy Number Variation Sequencing，CNV-seq）技術由于其具有檢測覆蓋面廣、通量高、易操作、所需DNA樣本量低等諸多優(yōu)點已被廣泛應用于包括非整倍體、微缺失、微重復等在內(nèi)的染色體畸變的檢測[1]?；诙檀?lián)重復序列（Short Tandem Repeat，STR）為核心的定量熒光PCR（Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction，QF-PCR）技術具有通量高、速度快（可以在數(shù)小時內(nèi)完成檢測并出具報告）、可檢測母血污染、準確性高[能診斷出99.2%～100.0%目標染色體（21、18、13、X和Y共5種染色體）的非整倍體異常][3-4]等特點。結合各自的優(yōu)勢和互補性，QF-PCR和CNV-seq的聯(lián)合使用可用于替代核型分析已成為專家共識[1]，因此這兩種技術的聯(lián)合使用已逐漸普及，為有產(chǎn)前診斷需求的人群，特別是無法做核型培養(yǎng)的人群提供了較好的選擇。本研究通過對比分析本院106例QF-PCR聯(lián)合102例CNV-seq及4例核型分析的檢測情況，探討這些技術在染色體畸變診斷中的臨床應用價值及聯(lián)合檢測的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年5月至2019年9月因高齡、血清學唐氏篩查異常、B超異?；驘o創(chuàng)產(chǎn)前檢查（Noninvasive Prenatal Testing，NIPT）高風險等來本院產(chǎn)前診斷中心進行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，均對其進行各種產(chǎn)前診斷方法的介紹，填寫知情同意書、自愿選擇相應的檢測。105位孕婦，共抽取羊水106例（1例為雙胎），其中CNV-seq（102例）、核型分析（4例），所有106例樣本均同時進行了QF-PCR檢測。

1.2 試劑與儀器

21、18、13及性染色體非整倍體檢測試劑盒（熒光PCR毛細管電泳法）購自中山大學達安基因股份有限公司以及廣州市達瑞生物技術股份有限公司，甲酰胺、Liz600、ABI3500DX測序儀和Gene-Mapper5.0軟件均購自美國賽默飛世爾科技有限公司，K5800微量分光光度計購自北京凱奧公司。

1.3 方法

1.3.1 羊水QF-PCR檢測

在檢驗科分子診斷室，使用核酸提取和QF-PCR試劑盒，大體步驟如下。羊水DNA提?。喝?.9mL羊水離心去上清，沉淀使用核酸提取試劑盒提取羊水基因組DNA，K5800微量分光光度計檢測DNA的質(zhì)量和濃度，-20℃保存；QF-PCR檢測分析：前89例采用達安試劑盒（15個STR位點），后17例采用達瑞試劑盒（20個STR位點）；PCR擴增均參照對應試劑盒說明書；擴增后取1μL PCR產(chǎn)物和13.5μL甲酰胺、0.5μLLiz600混合，ABI3500DX進行片段分析，GeneMapper 5.0分析數(shù)據(jù)。

1.3.2 羊水CNV-seq檢測

本檢測抽取待檢孕婦的羊水和抗凝全血交由湖南家輝遺傳專科醫(yī)院進行檢測，參照文獻中的方法[5]，大體步驟如下：提取羊水DNA，限制性內(nèi)切酶水解獲得平均大小為200bp的DNA片段，采用PCR-free方法制備文庫（北京貝瑞和康生物技術有限公司），連接接頭，在NextSeq CN500高通量測序平臺，36 bp單端測序，測序深度0.1X。所有測定序列，通過平行比對軟件與hg19人類基因組進行完全比對分析。以100kb為基本分析單元，將人類基因組劃分為若干個連續(xù)區(qū)域，統(tǒng)計每個區(qū)域內(nèi)樣本完全匹配的uniq reads序列數(shù)。采用專用算法判讀樣本的CNV，根據(jù)統(tǒng)計結果，以標準化測序拷貝數(shù)為y軸，以每條染色體連續(xù)的100kb分析單元為x軸，繪制CNV-seq檢測結果圖，判斷待測樣本的染色體情況。通過檢索CNV比對常用數(shù)據(jù)庫最新公布數(shù)據(jù)進行CNV臨床意義的確定[5]。

1.3.3 羊水染色體核型分析

在本院產(chǎn)前診斷中心，按常規(guī)方法對10mL羊水離心，取沉淀中的羊水細胞培養(yǎng)，制備染色體G顯帶，參照ISCN（2016）標準進行核型分析。

2 結果

2.1 QF-PCR與CNV-seq及染色體核型分析結果的對比

將QF-PCR測定的核型正常作為陰性，異常作為陽性，在21、18、13、X、Y共5種染色體（下文中均簡稱為5種染色體）的非整倍體檢測方面，QF-PCR與CNV-seq和染色體核型對比，依據(jù)QF-PCR測得的核型分，結果如下：46XX QF-PCR 43例，CNV-seq符合42例，核型分析符合1例，符合率均為100%；46XY QF-PCR 49例，CNV-seq符合48例，核型分析符合1例，符合率均為100%；47XX+18 QF-PCR3例，CNV-seq符合2例，核型分析符合1例，符合率均為100%；47XY+18 QF-PCR1例，CNV-seq符合1例，符合率為100%；47XX+21QF-PCR6例，CNV-seq符合5例，核型分析符合1例，符合率均為100%；47XXY QF-PCR3例，CNV-seq符合3例，符合率為100%；47XYY QF-PCR1例，CNV-seq符合1例，符合率為100%。因此，QF-PCR與CNV-seq及核型分析的陽性符合率、陰性符合率、總符合率均為100%。

2.2 CNV-seq陽性，但QF-PCR無法檢出的標本統(tǒng)計

CNV-seq檢出陽性但QF-PCR無法檢出的共21例，其中，CNV多態(tài)性7例，致病性未知3例，明確致病11例，見表1。

2.3 CNV-seq檢出陽性，但染色體核型無法檢出的標本統(tǒng)計

CNV-seq檢出陽性，而QF-PCR無法檢出的標本共21例，其中1例2號染色體q33.1-q37.3處重復39.48Mb，染色體核型是能檢測的，其余20例標本的微缺失或微重復均小于4Mb，未達到染色體核型的分辨率（5Mb），見表1。

表1 CNV檢出陽性，但QF-PCR無法檢出的標本統(tǒng)計Table1 The specimen（CNV detected positive，butQF-PCR could notdetect）statistics

3 討論

本研究由于病例數(shù)較少，所以各種方法比較時所得的陽性符合率只能部分提示該方法的真實能力。

在本研究中，在5種染色體非整倍體檢測方面，QF-PCR與CNV-seq及核型分析相比，結果完全一致，提示QF-PCR作為產(chǎn)前診斷項目，其準確性符合要求，這和指南及文獻是一致的[3-4]。

在全部染色體檢測方面，本研究中，除CNVseq多態(tài)性外，CNV-seq陽性但QF-PCR無法檢出的14例標本如果未做CNV-seq，而只做QF-PCR，可能就全部漏診了，文獻也報道了類似的情況[6-7]。上述結果也部分提示產(chǎn)前篩查高風險的標本發(fā)生CNV-seq異常的可能性也許會更高，例如唐篩21三體陽性的孕婦在只做QF-PCR驗證是否為21三體的同時，應同時選擇CNV-seq或核型分析排除其他染色體的異常。

雖然核型分析是目前染色體疾病診斷的金標準之一，但其分辨率較低，為5Mb左右，因此本研究中，除了兩例21三體陽性合并其他染色體微缺失的，其他18例如果只做核型分析，很可能均無法檢出，而這其中，CNV-seq陽性且明確致病的有9例。此結果顯示了CNV-seq較之核型分析技術的優(yōu)勢。

綜上所述，QF-PCR技術準確性高、速度快，可大大縮短報告的等待時間，緩解孕婦及家屬的焦慮情緒。但由于其局限性，在產(chǎn)前診斷時，需要和CNV-seq或核型分析等聯(lián)合檢測，這樣才能更好的發(fā)揮各自的優(yōu)勢。CNV-seq作為覆蓋面廣的產(chǎn)前診斷，也其必須使用QF-PCR進行母體細胞污染鑒別。因此，QF-PCR和CNV-seq聯(lián)合檢測具有速度快、通量高、覆蓋廣的優(yōu)勢，已逐漸成為產(chǎn)前診斷的一線方法。