mFOLFOX6化療聯(lián)合射頻消融治療原發(fā)性肝癌的療效及機(jī)制研究

符白玉 林怡 徐琪 張杰偉

原發(fā)性肝癌發(fā)病隱匿，臨床確診時(shí)多處于中晚期，大多數(shù)失去手術(shù)切除機(jī)會(huì)。射頻消融（radiofrequency ablation，RFA）為臨床新型微創(chuàng)技術(shù)之一，能局部徹底殺滅腫瘤細(xì)胞，療效明確且患者耐受性好[1]，在各種實(shí)體腫瘤中應(yīng)用較多，特別是原發(fā)性肝癌，被認(rèn)為是繼手術(shù)切除、介入治療后治療肝癌的第三大方法，且其治療小肝癌療效與手術(shù)切除相當(dāng)[2]。但受腫瘤大小、位置等影響，RFA治療范圍受限，可能影響原發(fā)性肝癌整體療效。mFOLFOX6為新輔助化療方案之一，通過調(diào)整藥物劑量以達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞藥物敏感度的目的。目前臨床關(guān)于mFOLFOX6化療+RFA治療原發(fā)性肝癌相關(guān)報(bào)道尚少，基于此，本研究通過對(duì)照試驗(yàn)分析mFOLFOX6化療聯(lián)合RFA治療原發(fā)性肝癌的療效及對(duì)相關(guān)血清指標(biāo)及10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）通路相關(guān)基因表達(dá)的影響，以為臨床肝癌治療提供新方向，改善患者預(yù)后。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

抽取本院2014年1月至2017年1月收治的原發(fā)性肝癌患者94例，隨機(jī)數(shù)字表格法將其分為觀察組與對(duì)照組，各47例。觀察組中男30例，女17例；年齡33～67歲，平均（47.62±10.34）歲；腫瘤直徑≥5cm者33例，＜5cm者14例；其中單發(fā)37例，多發(fā)10例。對(duì)照組中男28例，女19例；年齡34～68歲，平均（48.10±10.58）歲；腫瘤直徑≥5cm者30例，＜5cm者17例；其中單發(fā)35例，多發(fā)12例。上述一般資料2組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]；腫瘤數(shù)目不超過3個(gè)；未累及鄰近器官、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；符合RFA適應(yīng)證；均在本院接受治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：凝血機(jī)制異常；黃疸、肝外組織器官轉(zhuǎn)移；肝腎原發(fā)性疾病；RFA禁忌癥；相關(guān)藥物過敏；相關(guān)資料不全者。

1.3 試劑與儀器

奧沙利鉑購(gòu)自南京制藥廠有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20000686；亞葉酸鈣購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20000584；氟尿嘧啶購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020593；血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、糖類抗原199（carbohydrate antigen199，CA199）及甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，分別為a12871、JL10364、0-009644、JL23952；RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為T9424；RT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司，貨號(hào)為4655885001；RITA1500X射頻消融治療系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)RITA公司，包括射頻發(fā)生器、負(fù)極板、射頻電極等，輸出頻率460kHz±5%；ZF-6紫外分析儀購(gòu)自上海市金鵬分析儀器有限公司，波長(zhǎng)254 nm、365nm；RDY-SP8型瓊脂糖電泳儀購(gòu)自上海市金鵬分析儀器有限公司，包括凝膠板、緩沖液、電泳槽等；PTEN、VEGF與缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）引物均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.4 治療方法

觀察組行mFOLFOX6化療聯(lián)合RFA治療，先給予RFA處理：根據(jù)患者腫瘤位置選擇合適體位及進(jìn)針路線，確定穿刺點(diǎn)及深度，局部麻醉成功后于超聲或計(jì)算機(jī)斷層掃描（computerized tomography，CT）引導(dǎo)下將射頻針穿刺到腫瘤靶位置，依據(jù)腫瘤直徑及位置確定消融相關(guān)參數(shù)：溫度80℃～100℃，時(shí)間10～30min；通常消融范圍為腫瘤及正常肝組織（0.5～1.0）cm。RFA治療7d后給予mFOLFOX6化療：奧沙利鉑85mg/m2靜滴，第1d；亞葉酸鈣400mg/m2靜滴，第1d；氟尿嘧啶500mg/m2靜滴，第1、2 d。1個(gè)化療周期2周，連續(xù)干預(yù)3個(gè)周期。對(duì)照組僅給予RFA治療，操作方法同觀察組。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 近期療效

以實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[3]為依據(jù)，完全緩解（complete remission，CR）：靶病灶全部消失，腫瘤標(biāo)志物水平降至正常范圍，且持續(xù)至少4周；部分緩解（partial remission，PR）：病灶長(zhǎng)徑總和縮小30%以上，且持續(xù)至少4周；穩(wěn)定（stable disease，SD）：介于PR與疾病進(jìn)展（progression disease，PD）間；PD：病灶長(zhǎng)徑總和增大20%以上，或新病灶出現(xiàn)。有效率（response rate，RR）=CR率+PR率；疾病控制率（disease control rate，DCR）=100%-PD率。

1.5.2 血清指標(biāo)測(cè)定

分別于治療前、治療后2周空腹抽取患者外周靜脈血3mL，以2000r/min速率常規(guī)離心，離心15min，血清提取后保存待測(cè)。均通過ELISA測(cè)定2組患者血清VEGF、b FGF、CA199及AFP水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.5.3 PTEN通路相關(guān)基因測(cè)定

包括PTEN、VEGF與HIF-1mRNA表達(dá)，于治療后7d行腫瘤組織活檢，檢測(cè)方法為逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）：依據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取肝組織標(biāo)本總RNA，采用紫外分析儀、瓊脂糖電泳儀分別對(duì)總RNA濃度、完整性進(jìn)行檢測(cè)。按照RT試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，行t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 近期療效

觀察組RR、DCR均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 2組近期療效比較[n=47,（%）]Table1 Comparison of short-term curative effect between the 2 groups[n=47,（%）]

2.2 血清VEGF、bFGF水平變化

與治療前比較，2組治療后血清VEGF、bFGF水平均明顯下降（P＜0.05）；觀察組治療后血清VEGF、bFGF水平均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 2組治療前后血清VEGF、b FGF水平比較[（±s，pg/mL），（n=47）]Table2 Comparison of serum VEGF and bFGF levels before and after treatment in the 2 groups[（±s，pg/mL），（n=47）]

表2 2組治療前后血清VEGF、b FGF水平比較[（±s，pg/mL），（n=47）]Table2 Comparison of serum VEGF and bFGF levels before and after treatment in the 2 groups[（±s，pg/mL），（n=47）]

注：與同組治療前比較，aP＜0.05；與對(duì)照組治療后比較，bP＜0.05。

組別觀察組對(duì)照組時(shí)間治療前治療后治療前治療后VEGF 283.57±20.21175.34±20.16ab 284.28±21.49 228.32±19.34a bFGF 8.69±5.023.45±4.06ab 8.71±4.836.06±4.31a

2.3 血清CA199、AFP水平變化

與治療前比較，2組治療后血清CA199、AFP水平均明顯下降差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組治療后血清CA199、AFP水平均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 2組治療前后血清CA199、AFP水平比較［n=47,（±s）］Table3 ComparisonofserumCA199andAFPlevelsbefore andaftertreatmentinthe2groups［n=47,（x±s）］

表3 2組治療前后血清CA199、AFP水平比較［n=47,（±s）］Table3 ComparisonofserumCA199andAFPlevelsbefore andaftertreatmentinthe2groups［n=47,（x±s）］

注：與同組治療前比較，aP＜0.05；與對(duì)照組治療后比較，bP＜0.05。

組別觀察組對(duì)照組時(shí)間治療前治療后治療前治療后CA199（U/L）80.15±9.31 34.26±5.10ab 79.87±10.00 64.13±7.89a AFP（ng/mL）183.16±35.24 73.17±9.38ab 182.94±37.02 130.25±20.11a

2.4 肝組織PTEN通路相關(guān)基因表達(dá)

觀察組治療后PTENmRNA表達(dá)比對(duì)照組高，而VEGF、HIF-1mRNA表達(dá)比對(duì)照組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 2組治療后PTEN、VEGF與HIF-1mRNA表達(dá)量比較[n=47，（±s）]Table4 Comparison of PTEN，VEGF and HIF-1mRNA expression after treatment in the 2 groups[n=47，（±s）]

表4 2組治療后PTEN、VEGF與HIF-1mRNA表達(dá)量比較[n=47，（±s）]Table4 Comparison of PTEN，VEGF and HIF-1mRNA expression after treatment in the 2 groups[n=47，（±s）]

組別觀察組對(duì)照組t值P值PTEN 142.69±19.26 100.02±11.9512.9060.000VEGF 70.23±8.13100.12±11.7014.3830.000HIF-168.09±7.26 100.01±9.8717.8600.000

2.5 不良反應(yīng)情況

所有患者均無嚴(yán)重RFA相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生。觀察組化療期間發(fā)生白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少1例，輕度肝功能損害3例。

3 討論

臨床發(fā)現(xiàn)，受肝動(dòng)脈解剖、側(cè)支循環(huán)形成等多種因素影響，肝動(dòng)脈化療栓塞（transcatheter hepatic arterial chemoembolization，TACE）治療原發(fā)性肝癌遠(yuǎn)期療效不理想[4]。對(duì)此建議尋找新的手段或聯(lián)合RFA及其他方法治療[5-7]。

RFA以超聲或CT為引導(dǎo)，可直接將電極引入腫瘤內(nèi)部，經(jīng)由高頻電流生熱讓局部腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)變性及凝固性壞死，最終致使腫瘤組織脫落，達(dá)到徹底殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[8]。若溫度不能促使腫瘤組織壞死，腫瘤內(nèi)附近血管組織因射頻作用會(huì)形成反應(yīng)帶（約10mm），對(duì)腫瘤血液供應(yīng)阻斷，以誘導(dǎo)癌組織死亡，減少轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[9]。苗同國(guó)等[10]研究表明RFA能有效改善原發(fā)性肝癌患者細(xì)胞免疫功能。由于RFA治療范圍有限，為進(jìn)一步提高原發(fā)性肝癌療效，我們采取RFA聯(lián)合化療方案治療。mFOLFOX6化療方案包括奧沙利鉑、亞葉酸鈣、氟尿嘧啶成分，其中氟尿嘧啶于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成脫氧核苷酸，抑制并破壞DNA之胸苷酸合成酶合成，且氟尿嘧啶通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入核糖核酸，對(duì)蛋白質(zhì)合成影響，可對(duì)細(xì)胞形成各時(shí)期作用。臨床發(fā)現(xiàn)氟尿嘧啶與奧沙利鉑、亞葉酸鈣合用相對(duì)單藥干預(yù)效果明顯，且不顯著增加化療不良反應(yīng)[11]。

本研究結(jié)果顯示相比單純RFA治療，RFA聯(lián)合mFOLFOX6化療治療近期療效顯著，與胡十齊等[12]研究結(jié)果相符。表明RFA聯(lián)合化療治療原發(fā)性肝癌療效更好，這是因?yàn)镽FA通過高頻電流殺滅腫瘤細(xì)胞，聯(lián)合化療藥物能更徹底的殺滅腫瘤細(xì)胞。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療不顯著增加化療毒副反應(yīng)，患者可耐受。本研究還從血清分子指標(biāo)及腫瘤生長(zhǎng)信號(hào)通路方面評(píng)價(jià)原發(fā)性肝癌治療效果及預(yù)后。血清指標(biāo)指標(biāo)方面，VEGF為臨床常見血管生長(zhǎng)因子之一，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性作用以參與實(shí)體瘤血管新生、侵襲及轉(zhuǎn)移過程。bFGF除了對(duì)正常組織影響外，還參與腫瘤間質(zhì)血管新生、侵襲等。張惠潔等[13]研究發(fā)現(xiàn)TACE聯(lián)合索拉非尼相比單純TACE能明顯降低肝癌患者血清VEGF、bFGF水平。本研究結(jié)果顯示相比單純RFA治療，RFA聯(lián)合mFOLFOX6化療能進(jìn)一步降低血清VEGF、bFGF水平，抑制癌細(xì)胞活性，阻斷其轉(zhuǎn)移。這不但與RFA阻斷血供，抑制腫瘤新生血管形成有關(guān)，而且與mFOLFOX6化療藥物促使腫瘤細(xì)胞死亡，減輕腫瘤負(fù)荷，進(jìn)而促使VEGF、bFGF水平降低有關(guān)。為此筆者認(rèn)為VEGF、bFGF下降可作為原發(fā)性肝癌疾病控制評(píng)價(jià)指標(biāo)。AFP、CA199為臨床常見腫瘤標(biāo)記物[14]，也被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)指標(biāo)，其中AFP為原發(fā)性肝癌診斷敏感性指標(biāo)。CA199常用于消化系統(tǒng)腫瘤診斷及觀察，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)大部分原發(fā)性肝癌患者血清CA199水平升高，認(rèn)為CA199可與AFP等指標(biāo)一同成為原發(fā)性肝癌療效判斷指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果顯示RFA聯(lián)合mFOLFOX6化療相比RFA單獨(dú)治療能進(jìn)一步降低原發(fā)性肝癌患者血清CA199、AFP水平，可見聯(lián)合治療可徹底殺滅腫瘤細(xì)胞，促使血清腫瘤標(biāo)記物趨于正常，也降低了治療后復(fù)發(fā)幾率。腫瘤生長(zhǎng)信號(hào)通路方面，PTEN信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞增殖、凋亡，在腫瘤血管生成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[16]。PTEN為抑癌基因之一，大部分腫瘤內(nèi)其表達(dá)下降。VEGF、HIF-1屬于PTEN信號(hào)通路下游基因，腫瘤缺氧時(shí)，HIF-1可作為轉(zhuǎn)錄激活介質(zhì)，結(jié)合于VEGF啟動(dòng)相關(guān)因子，促VEGF表達(dá)及VEGF受體轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而腫瘤血管新生形成[17]。本研究顯示，mFOLFOX6化療聯(lián)合RFA治療能有效增強(qiáng)肝癌組織PTEN表達(dá)，抑制VEGF、HIF-1基因表達(dá)，阻斷腫瘤細(xì)胞血液供應(yīng)，進(jìn)而降低血管形成相關(guān)指標(biāo)VEGF、bFGF水平，促腫瘤細(xì)胞凋亡及腫瘤標(biāo)記物下降，提高治療效果。受觀察時(shí)間影響，本研究未分析其復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)期存活率，有待日后通過延長(zhǎng)觀察時(shí)間進(jìn)一步探究。

綜上，mFOLFOX6化療聯(lián)合RFA治療原發(fā)性肝癌近期療效較好，且較安全，能明顯降低血清bFGF、CA199水平，調(diào)節(jié)PTNE信號(hào)通路。