非梗阻性無精子癥患者X染色體連鎖的TEX11基因多態(tài)性研究

羅招云 李緒杰 林芬 查廣才 楊立業(yè)★

在全世界范圍內(nèi)，男性不育無精子癥的發(fā)病率高達15%～20%，并呈現(xiàn)出快速增長的趨勢[1]。男性不育癥已成為一個嚴重的生殖健康問題[2]。大多數(shù)非阻塞性無精子癥的遺傳基礎(chǔ)還未知[3]。遺傳因素常被認為是無精子癥中男性不育的主要原因[4]，X染色體連鎖的TEX11基因在睪丸中表達，與精子發(fā)生功能有關(guān)[5]，TEX11的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與特發(fā)性男性不育密切相關(guān)[6]。TEX11缺乏導致減數(shù)分裂停滯和雄性不育，對無精子癥患者進行TEX11突變篩查是為了查明雄性不育潛在的因素[7]。本研究收集潮州地區(qū)35例男性非阻塞性無精子癥患者血液標本，進行TEX11的SNP檢測，探討其與無精子癥發(fā)生的關(guān)系，對它的發(fā)生率及其基因型別進行統(tǒng)計，評估TEX11的SNP與無精子癥之間的相關(guān)性及其可能在中國非阻塞性無精子癥患者發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 樣本來源

選取2012年6月至2018年5月來我院泌尿外科和生殖醫(yī)學科就診的男性患者為實驗對象，實驗組納入標準參照文獻[8-9]對無精子癥的診斷標準，即射出的精液離心后鏡檢未觀察到精子，且通過3次和3次以上離心鏡檢，同時排除逆行射精和不射精等，即可診斷為無精子癥。離心標準：取出1mL精液，以3000g（4096r/min）離心15min，余下約50μL精漿。以納入標準收集到217例無精子癥患者血液樣本。排除標準為男性無輸精管炎癥、睪丸（附睪）炎癥、精囊炎、輸精管道缺如、輸精管道阻塞、Y染色體微缺失。217例無精子癥患者篩選出35例非梗阻性無精子癥患者為實驗對象，年齡20～43歲，平均年齡（30.11±5.13）歲，平均體重（58.37±2.43）kg。對35例血液標本進行X染色體上TEX11的SNP檢測。

收集2018年2月至5月來本院體檢中心體檢的30例生精正常的男性血液標本作為對照組。年齡26～47歲，平均年齡（32.11±3.57）歲，平均體重（61.37±1.82）kg。經(jīng)詳詢，30例男性均是在未采取避孕措施下1年內(nèi)使妻子自然受孕。

1.1.2 儀器與試劑

XP基因擴增儀（型號：TC-XP-D，貨號：BYQ602402Y-273）購自杭州博日科技有限公司；電泳儀：電泳槽（型號：DYCP-38B型，貨號：No.0838B-191-06）和電泳儀電源（型號：DYY-6C型，出廠編號：15。新6C.1210-11），均購自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon Gellmage System，型號：Tanon-1600，貨號：15T5561-313）購自中國上海天能科技有限公司。外周血全血DNA提取試劑盒（型號：全血DNA溶液型，批號：W201708002）購自深圳亞能生物技術(shù)有限公司，DNA maker（型號：M1091/M1092，批號：014）購自廣州東盛生物科技有限公司，2×Tap PCR MasterMix（型號：PC0902，批號：282238AX）購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取

外周血DNA的提取嚴格按照全血DNA提取試劑盒說明書操作，制備好的DNA樣品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計和合成

利用Primer premier 3.0引物設(shè)計工具，將29個TEX11的基因序列編碼外顯子序列分段設(shè)計合成，其中3個基因序列引物自行設(shè)計，見表1；另26個基因序列引物參照參考文獻[3]。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增TEX11DNA

在XP基因擴增儀上經(jīng)過PCR溫度梯度實驗，逐一確定29對引物擴增合適的退火溫度，見表1，PCR擴增的體系參數(shù)和反應(yīng)條件如下：PCR擴增的體系參數(shù)：Mix Taq，12.5μL；純凈水，8.5μL；上下游引物各1.0μL；總cDNA，2.0μL；體系總體積25.0μL。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，退火30s（溫度見表1），72℃延伸50s，循環(huán)35次；72℃延伸5～10min。在確定各對引物PCR擴增退火溫度下，對35例非梗阻性無精子癥患者的DNA標本進行外顯子序列分段式擴增。

表1 TEX11基因的3個編碼外顯子DNA引物和PCR擴增退火溫度Table1 The 3coding exon DNA primers of the TEX11 gene and PCR amplification annealing temperature

1.2.4 電泳

用1.5%瓊脂糖凝膠，200V電壓，140mA電流，電泳時間為25min，對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，電泳結(jié)束后將凝膠輕置于Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)中，觀察DNA條帶亮度、位置，拍照記錄。

1.2.5 PCR產(chǎn)物測序

將合格的PCR擴增產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)公司（廣州）進行測序。

1.2.6 基因序列比對

根據(jù)測序出來的結(jié)果，通過Chromas測序分析軟件人工查看測序圖確認檢測結(jié)果是否成功，將測出的正反向基因序列通過pubmed的Nucleotide BLAST數(shù)據(jù)庫進行比對，以確定非梗阻性無精子癥患者X染色體上的TEX11基因是否發(fā)生突變，突變位點排除雜合子突變。

1.3 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，用卡方檢驗對實驗組和對照組的突變率進行統(tǒng)計，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基因測序結(jié)果分析

在35例實驗組患者標本中檢測到2種錯義突變類型，分別是Exon7：c.389A＞G，突變率37.1%Exon 17：c.1351G＞A，突變率8.6%。2種錯義突變引起的編碼氨基酸變化分別是：c.Lys 130Arg和c.Gl u451Ly s；在對照組中發(fā)現(xiàn)Exon7、Exon 17也有相同位點突變，突變率分別為：37.5%、8.3%此外，在實驗組中發(fā)現(xiàn)2處同義突變，分別是Exon 27：c.2319 T＞A，突變率為71.4%；Exon 29 c.2541T＞C，突變率為20.0%。在實驗組和對照組中都發(fā)現(xiàn)了TEX11的2個外顯子相同位點的突變（Exon 7：c.389 A＞G，Exon 17：c.1351G＞A），見表2和圖1。；。：

表2 非梗阻性無精子癥患者和對照組TEX11基因外顯子編碼基因序列突變[n（%）]Table2 TEX11 genemutation of the exon encoding sequence inmales with non-obstructive azoospermia and the controlgroup[n（%）]

圖1 非梗阻性無精子癥患者TEX11基因的2處錯義突變Figure1 2missensemutations in the TEX11 gene of non-obstructive azoospermia

3 討論

在成人男性中，高達1%的人群患有無精子癥[10]，男性不育患者中有近25%是非梗阻性無精子癥導致的[11]。非梗阻性無精子癥是一種多因素疾病，其分子基礎(chǔ)仍然大部分未知，幾乎一半的男性不育癥與遺傳缺陷有關(guān)[3]。目前，國內(nèi)外對男性非梗阻性無精子癥的TEX11基因突變研究報告極少。關(guān)于X染色體上的生精基因研究會逐漸成為國際上的研究熱點，包括TEX11基因在內(nèi)的基因已被報道為無精子癥的可能關(guān)聯(lián)因素[12-13]。TEX11基因表達蛋白是一種X染色體編碼的生殖細胞特異性蛋白質(zhì)，在睪丸中的精原細胞和早期精母細胞中表達量最大[14]。TEX11基因在精子發(fā)生早期扮演一個重要角色[15]。TEX11基因是減數(shù)分裂的一個明確因素[16]。TEX11基因突變導致減數(shù)分裂停滯，是精子形成失敗導致非梗阻性無精子癥的原因，TEX11基因?qū)影l(fā)生障礙有重要意義[3-4]。

目前，由基因異常導致的男性不育主要是：性染色體與生精基因的缺失與突變、常染色體基因的缺失與突變[17]。不少學者研究不育男性X連鎖的TEX11基因突變[3-4]。目前，共發(fā)現(xiàn)TEX11基因有46個不同突變[3-4]。TEX11基因突變發(fā)生率在德國是2.4%（7/289），在美國無精子癥患者中的發(fā)生率是14.5%（35/246）[3-4]，本研究TEX11基因突變發(fā)生率是37.1%（13/35）。TEX11基因突變發(fā)生率差異可能與種族特點不同有關(guān)[7]。在一項試驗中，敲除老鼠TEX11基因上共30個外顯子中的27個，染色體在粗線期不結(jié)合使精子發(fā)生受損，導致細胞死亡和雄性不育[16]。Yatsenko等[3]通過研究發(fā)現(xiàn)6個不同TEX11基因突變，包括外顯子9～11缺失（607del1237bp），3個剪切突變（c.405C＞T，748+1G＞A，1793+1G＞C），2個錯義突變（c.466A＞G，2047G＞A）。Yang等[4]發(fā)現(xiàn)40個不同TEX11突變，18個在無精子癥患者中檢測出，包括5個外顯子錯義突變（W117R，V142I，Q172R，T244I，V748A），2個外顯子無義突變（405C＞T，2319T＞C），1個外顯子移碼突變，10個內(nèi)含子突變；另22個在正常生育男性中發(fā)現(xiàn)，其中4個外顯子錯義突變（K115R，M152V，E436K，D832E）。日本研究者[10]對包括TEX11基因在內(nèi)的25個相關(guān)基因進行突變篩選，發(fā)現(xiàn)1個TEX11突變（c.A511G，Met171Val）。在中國人群中，僅有1篇文獻報道1對不育兄弟在TEX11基因的29號外顯子上發(fā)現(xiàn)2653G＞T[7]。本研究的TEX11基因30個外顯子發(fā)現(xiàn)4個SNP，2個外顯子錯義突變（Exon 7：c.389 A＞G；Exon 17：c.1351G＞A）和2種無義突變，與上述研究者發(fā)現(xiàn)的基因突變位點均不相同，與歐美基因突變位點不同的原因可能是人種不同；與日本研究者的不同，可能與本實驗樣本例數(shù)太少有關(guān)。本研究實驗組和對照組中都有相同位點2個錯義突變，推測這2種突變不影響TEX11基因的功能，與Ya n g等[4]研究的結(jié)論基本一致。在正常生育男性中發(fā)現(xiàn)TEX11基因突變，以及大部分TEX11基因突變準確原因還不明確，可能提示這些突變與無精子生成不相關(guān)[4]。這么豐富的TEX11突變增加了診斷導致雄性不育的困難[7]。Zhang等[6]研究闡述了TEX11基因的SNP與無精子癥具有相關(guān)性；TEX 11基因突變在男性不育中，特別是與無精子癥有密切相關(guān)[7]。

綜上所述，TEX11基因的SNP在非梗阻性無精子癥的臨床意義目前是不明確的，與Mitchell等人[18]的研究結(jié)論是一致的，TEX11基因功能目前與男性不育的關(guān)系還無定論，本研究結(jié)果的結(jié)論也是如此。鑒于本研究樣本例數(shù)少，生育男性也發(fā)現(xiàn)TEX11基因突變，因此在潮州地區(qū)人群中TEX11基因與男性不育的關(guān)系還有待更進一步深入研究。在檢測TEX11基因突變時，結(jié)合睪丸組織學活檢和不育史家系調(diào)查，更有助于得出TEX11基因突變與男性不育的相關(guān)性[7]。