急性髓細(xì)胞白血病患兒miR-126表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系研究

容蓉 班奕 周肖瀅 王瀟娉 王小明

急性髓細(xì)胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）為一種異質(zhì)性較強(qiáng)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，患者細(xì)胞對(duì)骨髓的侵襲抑制了紅系和巨核系造血祖細(xì)胞的增殖，出現(xiàn)貧血及血小板減少。因白血病（acute leukemia，AL）原始細(xì)胞形態(tài)學(xué)相似，單一骨髓細(xì)胞顯微鏡檢查診斷率約為80%，無(wú)法早期篩查及判斷預(yù)后，因此明確其發(fā)病機(jī)制是關(guān)鍵[1]。microRNA（miRNA，簡(jiǎn)稱miR）參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、生長(zhǎng)發(fā)育及腫瘤發(fā)生等眾多生物學(xué)過(guò)程，研究表明miRNA可通過(guò)調(diào)控耐藥相關(guān)基因或抑癌基因表達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞化療敏感性方面發(fā)揮重要作用，早期有學(xué)者指出miR-181a在急性淋巴細(xì)胞白血病患兒、miRNA-125b在急性白血病中發(fā)揮作用[2-3]。而miR-126也是miRNA家族中的一員，研究顯示臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的顆粒攜帶miRNA-126可促進(jìn)單核細(xì)胞遷移，微顆粒作為載體可攜帶miRNAs介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳遞，但miRNA-126在兒童AML中的表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系研究較少[4]。本文對(duì)miR-126表達(dá)水平及miR-126與預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年5月至2016年12月本院收治的AML患兒58例，納入研究組，均符合《兒童急性髓細(xì)胞白血病診療建議》[5]中AML診斷標(biāo)準(zhǔn)，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均首診為AML，經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)、細(xì)胞組織化學(xué)染色、細(xì)胞免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)確診；②既往無(wú)腫瘤病史，年齡在14歲以下，確診后采用標(biāo)準(zhǔn)化誘導(dǎo)方案進(jìn)行化療；③患兒監(jiān)護(hù)人簽署相關(guān)知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①治療相關(guān)性白血病、21三體綜合征相關(guān)性白血病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病等；②合并其他腫瘤或未按標(biāo)準(zhǔn)完善相關(guān)檢查者。同時(shí)選取同期入院的非惡性病兒童（特發(fā)性血小板減少性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡）30例為對(duì)照組，研究組中男31例，女27例；年齡2～13歲，平均年齡（7.45±1.11）歲，對(duì)照組中男16例，女14例；年齡1～13歲，平均年齡（7.42±1.15）歲，2組在性別、年齡等一般資料方面對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。依據(jù)出院時(shí)miR-126表達(dá)量相對(duì)水平將58例AML患兒分為高表達(dá)組、低表達(dá)組各29例，另根據(jù)《兒童急性髓細(xì)胞白血病診療建議》[5]將AML患兒分為臨床高危、中危、低危各16、20、22例，并依據(jù)預(yù)后情況分為完全緩解組、難治復(fù)發(fā)組、死亡組各18、26、14例，各亞組間一般資料比較差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑/儀器

7300Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，Power/PAC200水平電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司，凝膠成像分析儀購(gòu)自美國(guó)UVP公司。miRNA提取、探針、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與PCR擴(kuò)增酶均購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；引物序列購(gòu)自北京英俊生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2.1 miR-126表達(dá)水平測(cè)定

從標(biāo)本庫(kù)中抽取其骨髓標(biāo)本，采用TaqMan RT-PCR法檢測(cè)2組骨髓標(biāo)本中miR-126的表達(dá)，進(jìn)行總RNA抽提及miR-126特定的c DNA反轉(zhuǎn)錄，miR-126的提取依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，測(cè)定其濃度及OD260/280，在1.8～2.0者用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，濃度調(diào)整至2ng/μL，依據(jù)MicroRNA Assays說(shuō)明書進(jìn)行操作，選擇U 6作為內(nèi)參照，引物 序 列：miR126：5′UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG3′，U6：5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′，均進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄條件：反應(yīng)體系15μL[dNTP（100mM）0.15μL，逆轉(zhuǎn)錄酶（50U/μL）1.0μL，10×RTBuf fer1.5μL，RNA酶抑制劑（20U/μL）0.19μL，無(wú)RNA酶水4.16μL，RTmiR126/RT-U6探針3μL，RNA 5μL]，16℃30min；42℃30min；85℃5min；4℃，保持；反應(yīng)產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆茫罁?jù)產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行操作，PCR擴(kuò)增總體系：20μL[TagMan擴(kuò)增酶（20×）1μL，無(wú)RNA酶水7.67μL，TagMan2×Universal PCRMaster Mix（No Amp Erase UNG 10.0μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.33μL]，50℃2min；19℃10min，95℃15s，60℃1min，循環(huán)40個(gè)，依據(jù)CT值，分析以β-action、U6為內(nèi)參照，利用Ct值計(jì)算各組miR-126表達(dá)相對(duì)量，相對(duì)量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=ΔCt（試驗(yàn)樣本）-ΔCt（校準(zhǔn)樣本），ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（β-action），基因表達(dá)差異的倍數(shù)即2-ΔΔCt。

1.2.2 AML治療方案

以柔紅霉素（daunorubicin，DNR）、阿糖胞苷（cytarabine，Ara-C）[DA，3+7方案]或DNR、Ara-C聯(lián)合依托泊苷（etoposide，VP16）[DAV，3+7+3方案]進(jìn)行治療，具體為：①DA方案：DNR 30mg/（m2·d），第（1～3天）；Ara-C100～200mg/（m2·d），第（1～7天）；②DAV方案：DNR、Ara-C同上，另聯(lián)合VP16100mg/（m2·d），第（5～7天）。待患兒獲得骨髓緩解后，繼續(xù)按原方案完成2療程鞏固治療；鞏固治療后，完成5～6次大劑量Ara-C為主的強(qiáng)化治療，前3次連續(xù)應(yīng)用，后3次與標(biāo)準(zhǔn)劑量Ara-C交替應(yīng)用?？偗煶?～12個(gè)月。

1.2.3 隨訪及預(yù)后判斷

均完成1年隨訪，完全緩解（complete remission，CR）[6]：誘導(dǎo)緩解治療后第8復(fù)查骨髓達(dá)緩解標(biāo)準(zhǔn)，且持續(xù)3個(gè)月以上未見異常。難治復(fù)發(fā)性AML標(biāo)準(zhǔn)[7]：①標(biāo)準(zhǔn)方案誘導(dǎo)化療2個(gè)療程未獲得CR；②第一次CR后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)；③第一次CR后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)、經(jīng)原方案再誘導(dǎo)化療失敗；④2次或2次以上復(fù)發(fā)；⑤髓外白血病持續(xù)存在。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較研究組（分為高危、中危、低危）、對(duì)照組入院時(shí)骨髓標(biāo)本中miR-126表達(dá)量；②依據(jù)出院時(shí)miR-126表達(dá)量相對(duì)水平將58例AML患兒分為高表達(dá)組、低表達(dá)組各29例，比較2組miR-126表達(dá)量及中位生存時(shí)間、無(wú)事件生存時(shí)間、中位生存率，中位生存時(shí)間：自診斷起至死亡或末次隨訪時(shí)間，無(wú)事件生存時(shí)間：診斷至第一次事故發(fā)生或末次隨訪時(shí)間，事故包括復(fù)發(fā)、死亡與失訪；③依據(jù)1年內(nèi)隨訪結(jié)果將其分為完全緩解組、難治復(fù)發(fā)組、死亡組，比較3組入院時(shí)、出院時(shí)、末次隨訪時(shí)miR-126表達(dá)量；④分析AML患兒miR-126表達(dá)水平與其預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以%表示，采取χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，行t檢驗(yàn)，高危、中危、低?；純簃iR-126表達(dá)量及完全緩解組、難治復(fù)發(fā)組不同時(shí)點(diǎn)miR-126表達(dá)水平采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析（F檢驗(yàn)），相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組、對(duì)照組骨髓標(biāo)本中miR-126表達(dá)量

研究組骨髓標(biāo)本中miR-126表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；研究組中，高?；純簃iR-126表達(dá)量高于中危、低?；純海形?、低?；純簃iR-126表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 miR-126高表達(dá)組、低表達(dá)組miR-126表達(dá)量及預(yù)后情況比較

出院時(shí)miR-126高表達(dá)組miR-126表達(dá)量高于miR-126低表達(dá)組，而中位生存時(shí)間、無(wú)事件生存時(shí)間、中位生存率短/低于低表達(dá)組（P＜0.05）（表2）。

表1 研究組、對(duì)照組骨髓標(biāo)本中miR-126表達(dá)量比較Table1 Comparison ofmiR-126 expression in bonemarrowsamples of study group and controlgroup

2.3 完全緩解組、難治復(fù)發(fā)組、死亡組患者miR-126表達(dá)水平比較

3組出院時(shí)、末次隨訪時(shí)miR-126表達(dá)水平均明顯低于同組入院時(shí)，且完全緩解組出院時(shí)、末次隨訪時(shí)miR-126表達(dá)水平較難治復(fù)發(fā)組、死亡組低，難治復(fù)發(fā)組、死亡組miR-126表達(dá)水平差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表2 miR-126高表達(dá)組、低表達(dá)組miR-126表達(dá)量及預(yù)后情況比較[n=29，（%）]Table2 Comparison ofmiR-126 expression and prognosis inmiR-126 high expression group and lowexpression group[n=29，（%）]

表3 完全緩解組、難治復(fù)發(fā)組、死亡組患者miR-126表達(dá)水平比較[n，（±s）]Table3 Comparison ofmiR-126 expression in complete remission group and refractory recurrence group[n，（±s）]

表3 完全緩解組、難治復(fù)發(fā)組、死亡組患者miR-126表達(dá)水平比較[n，（±s）]Table3 Comparison ofmiR-126 expression in complete remission group and refractory recurrence group[n，（±s）]

注：與同組入院時(shí)比較，aP＜0.05；與完全緩解組比較，bP＜0.05；與難治復(fù)發(fā)組比較，cP＜0.05。

組別完全緩解組（n=18）難治復(fù)發(fā)組（n=26）死亡組（n=14）F值P值入院時(shí)1.78±0.111.75±0.09 1.78±0.08 F交互=18.976，F(xiàn)組間=7.865，F(xiàn)時(shí)點(diǎn)=11.329 P交互=0.000，P組間=0.004，P時(shí)點(diǎn)=0.000出院時(shí)1.34±0.25a 1.54±0.20ab 1.67±0.17abc 末次隨訪時(shí)1.12±0.13a 1.24±0.21ab 1.41±0.15abc

2.4 AML患兒miR-216表達(dá)水平與其預(yù)后的關(guān)系分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AML患兒入院時(shí)miR-216表達(dá)水平與其中位生存時(shí)間、無(wú)事件生存時(shí)間、中位生存率呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（表4）。

表4 AML患兒miR-216表達(dá)水平與其預(yù)后的關(guān)系分析Table4 The relationship betweenmiR-216 expression and prognosis in children with AML

3 討論

兒童AML可發(fā)生在任何年齡，無(wú)明顯性別差異。國(guó)際法美英（French，American and British，F(xiàn)AB）協(xié)作組根據(jù)形態(tài)學(xué)將其分為M0～M7共8種亞型，其中M3（急性早幼粒細(xì)胞白血病，acute promyelocytic leukemia，APL）是較特殊類型的AML[8]。隨著化療藥物發(fā)展，APL成為可以治愈的惡性白血病，但超過(guò)1/3的非APL的AML患兒預(yù)后不良，因此分析疾病相關(guān)特征及與患兒預(yù)后的關(guān)系是兒科醫(yī)師重點(diǎn)課題[9-10]。miRNA為一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，在基因網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中發(fā)揮主要的“調(diào)控節(jié)點(diǎn)”作用，可在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，以抑制翻譯或降解蛋白質(zhì)[11]。近年來(lái)miRNA在血液系統(tǒng)疾病造血鏈分化中的作用及癌基因與抑癌基因的雙重作用受到重視[12]。miR-126為位于9q34.3的內(nèi)皮細(xì)胞特異性miRNA，可通過(guò)靶基因介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）的反應(yīng)，在血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。張艷等[13]的研究結(jié)果顯示成人AML患者骨髓中miR-126相對(duì)表達(dá)水平較正常人群增高，尤其在M3型AML患者中表達(dá)水平明顯低于非M3型，可用于區(qū)分AML亞型。但目前關(guān)于miR-126在兒童中的表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系研究較少。

Li等[14]的研究結(jié)果顯示，miRNA-126與其反義鏈miRNA-126*在伴有t（8；21）與inv（16）染色體易位的AML中特征性過(guò)表達(dá)，在t（15；17）染色體變異的AML中，miRNA-126及miRNA-126*則下調(diào)。Li的進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，miRNA-126與AML1/ETO融合基因協(xié)同抑制AML細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活力，此外miRNA-126可通過(guò)負(fù)向調(diào)控PLK2基因，繼而抑制AML惡性細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)其增殖?？梢妋iR-126在AML中發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但其與預(yù)后的關(guān)系研究較少涉及。本次研究也表明AML患兒miR-126呈高表達(dá)狀態(tài)，且隨患兒臨床危重程度增加，miR-126表達(dá)量升高?？赡苁且?yàn)?，?jīng)剪切修飾的成熟miR-126進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，經(jīng)結(jié)合靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)抑制靶mRNA表達(dá)，通過(guò)抑制翻譯或降解靶mRNA的機(jī)制以實(shí)現(xiàn)相關(guān)調(diào)節(jié)，且隨著臨床病情加重這種機(jī)制更為明顯[15]。在與預(yù)后的關(guān)系方面，本研究結(jié)果顯示，出院時(shí)miR-126高表達(dá)組中位生存時(shí)間、無(wú)事件生存時(shí)間、中位生存率短/低于miR-126低表達(dá)組，表明出院時(shí)miR-126水平可較好預(yù)測(cè)AML患兒預(yù)后，低水平miR-126預(yù)示著預(yù)后更良好，這與Shibayama等[16]通過(guò)研究得出的microRNA-126-5p上調(diào)與阿糖胞苷耐藥性和不良預(yù)后有關(guān)的結(jié)果相近。但因條件限制，本研究預(yù)后評(píng)估方面未涉及AML患兒阿糖胞苷的耐藥性，且未對(duì)miR-126高表達(dá)預(yù)測(cè)不良預(yù)后的機(jī)制進(jìn)一步進(jìn)行分析，因此可將其作為后期進(jìn)一步研究?jī)?nèi)容。本研究也顯示，在出院時(shí)及隨訪中，完全緩解組miR-126表達(dá)水平均低于難治復(fù)發(fā)組、死亡組，難治復(fù)發(fā)組、死亡組miR-126表達(dá)水平差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且相關(guān)性分析結(jié)果也初步證實(shí)AML患兒miR-126表達(dá)水平與其預(yù)后存在一定關(guān)系，這與Li等[17]通過(guò)研究得出的AML患者miR-126高表達(dá)與不良生存率有明顯相關(guān)性的結(jié)果一致?？紤]是因?yàn)閙iR-126通過(guò)靶基因介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的反應(yīng)作用，使血管生成增多，因此miR-126水平高低可反映AML患兒病情并預(yù)測(cè)其預(yù)后水平與化療療效[18-19]，對(duì)miR-126的深入研究將會(huì)揭示AML新的發(fā)病機(jī)制，為其診斷提供新的分子標(biāo)志物，為AML的治療提供新思路。

綜上所述，AML患兒miR-126表達(dá)水平與其預(yù)后密切相關(guān)，miR-126表達(dá)水平可預(yù)測(cè)遠(yuǎn)期預(yù)后，因此可將其作為臨床治療靶點(diǎn)及預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)。