AMI患者發(fā)病后血漿UCA1、CK-MB、cTnI變化及其診斷價值分析

肖丹丹 張勇 陳秀紅 蘇婭 黃志萍

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是臨床主要急診危重疾病，其發(fā)病率在近年來呈升高及年輕化趨勢，AMI發(fā)病后1h內(nèi)得到救治，病死率約為1%，若在6 h后得到救治病死率為10%～12%[1]。常用的心肌損傷標志物如肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）、肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）診斷AMI缺乏特異性、靈敏度低、檢測窗口期短，在某些心臟及非心臟疾病中可出現(xiàn)假性升高，因此尋找早期診斷AMI的高敏感性與特異性的新標志物十分必要[2]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc RNA）為一種長度在200nt以上、不編碼蛋白質(zhì)的RNA，曾被認為是“基因翻譯的噪音”，無具體生物學功能[3]。lnc RNA在調(diào)節(jié)基因表達的過程中發(fā)揮重要作用，且有編碼微肽的潛在潛能[4]，而尿路上皮癌相關1（urothelial carcinoma associated 1，UCA1）是一種重要的lnc RNA，膀胱惡性腫瘤中UCA1有促進葡萄糖消耗及乳酸生成作用，推測UCA1在心臟供能中可能也起重要作用，在AMI凋亡或壞死的心肌細胞中可能釋放出UCA1，并在其血液中檢測到[5]。本文分析AMI患者發(fā)病后血漿UCA1變化及其診斷價值，現(xiàn)報告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2016年7月至2017年6月本院收治的AMI患者80例（AMI組），符合相關診斷標準[6]。AMI納入標準：①有典型AMI臨床表現(xiàn)、特征性心電圖改變、血清心肌標志物水平動態(tài)改變，滿足其中2項及以上；②對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①既往有心力衰竭、心肌病、房顫等心臟疾病史；②合并明確的惡性腫瘤；③近期內(nèi)接受過外科手術或有肌肉損傷史等可能影響肌源性lnc RNAs水平的因素。另選取同期入院體檢的健康志愿者30例為對照組，均于本院行心血管內(nèi)科冠狀動脈造影檢查，排除冠心病的診斷。AMI組男47例，女33例，年齡46～59歲，平均（51.25±5.15）歲；合并基礎疾?。焊哐獕翰∈?4例，糖尿病病史21例，高脂血癥病史51例，合并兩者及以上基礎疾病23例，對照組男14例，女16例，年齡45～60歲，平均（51.23±5.13）歲，2組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），有可比性。本研究獲得院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 AMI基礎檢查

入院后24 h內(nèi)行病例采集，包括常規(guī)體檢、實驗室檢查（血常規(guī)、血生化）、心電圖與心臟彩超等。

1.2.2 主要儀器與試劑

熒光定量PCR儀（LightCycler 480Ⅱ型）購自瑞士Roche公司；全自動生化分析儀（7600型）購自日本Hitachi公司；全自動免疫化學發(fā)光儀（ACCESS2型）購自美國Be c kman公司。CK-MB、cTnI檢測試劑盒均購自基蛋生物科技股份有限公司；Trizol試劑盒、miRcute增強型miRNAc DNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.3 UCA1、CK-MB、cTnI水平測定

1.2.3.1 血樣采集 對照組僅取入院0～2 h進行血樣采集，AMI組于入院0～2、2～6、6～12、12～24、24～48、48～72、72～96 h進行血樣采集。

1.2.3.2 CK-MB、cTnI、UCA1水平測定 將每例研究對象采集到的2管靜脈血，一管送檢心肌損傷標志物，采用酶法連續(xù)監(jiān)測法以全自動生化分析儀測定CK-MB，應用微粒子化學發(fā)光法以全自動免疫化學發(fā)光儀測定cTnI。

另一管靜置在4℃冷藏30min用于測定UCA1。測定方法：①取上述血樣本，在室溫、3000rpm離心15min，留取上層血漿，經(jīng)1%DEPC水浸泡過夜、消毒、烘干備用；②將分離所得血漿置于冰上融化，取250μL血漿樣品，加入750μL Trizol，振蕩器混勻后靜置5min，加入200μL氯仿，振蕩器混勻后靜置10min，室溫下離心12000rpm、10min，留取上清液并量取體積；③將上清液轉移至另一無Rnase的EP管，加入等體積異丙醇混勻，后離心、加入1mL 75%乙醇、離心、晾干、溶解RNA、分光光度計測定總RNA濃度、純度；④將RNase Free的反應管內(nèi)試劑在68℃水浴箱中靜置5min，取出放入冰盒，配制反應液，短暫離心混勻后置于37℃水浴箱中60min合成cDNA；⑤冰上融化2×qPCR SuperMix、上游引物及下游引物，配制反應體系（2×qPCR SuperMix 10μL，上游引物（ACGCTAACTGGCACCTTGTT）0.5μL，下游引物（TGGGGATTACTGGGGTAGGG）0.5μL，內(nèi)參照引物：U6 RNA上游引物：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，U6 RNA下游引物：U6 RNA下游引物：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT，cDNA模板1μL，ddH2O 8μL），短暫離心混勻，并設定qPCR反應程序（95℃1min，1次；95℃20s，61℃31s，循環(huán)45次），測定lnc RNA。UCA1相對表達量采用公式2-△△Ct計算，Ct為目標擴增產(chǎn)物達到設定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)。

1.2.4 AMI治療

確診后所有患者臥床3d以上，均持續(xù)心電監(jiān)護，并對癥給予吸氧、鎮(zhèn)靜止痛、再灌注、抗心律失常等治療。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，行t檢驗，應用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析UCA1、CK-MB、cTnI對AMI的診斷效能，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AMI組、對照組血漿UCA1、CK-MB、cTnI水平比較

與對照組相比，AMI組入院后整體UCA1表達水平先下調(diào)，后上調(diào)；具體情況。見表1。

2.2 AMI組中合并不同疾病患者UCA1、CKMB、cTnI表達水平比較

單純AMI、合并高血壓、合并糖尿病、合并高脂血癥、合并2種及以上基礎疾病患者UCA1、CK-MB、cTnI表達水平分別兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 UCA1、CK-MB、cTnI診斷AMI的效能分析

取AMI組入院后6～12h血漿樣本20份，分析UCA1、CK-MB、cTnI水平診斷AMI的效能。結果顯示UCA1診斷AMI的靈敏度、特異度、準確度、ROC曲線下面積分別為85.42%、83.14%、86.11%、0.954均高于CK-MB診斷AMI的靈敏度、特異度、準確度、ROC曲線下面積分別為63.45%、78.96%、75.68%、0.769和cTnI診斷AMI的靈敏度、特異度、準確度、ROC曲線下面積分別為67.89%、78.15%、71.57%、0.853。見圖1。

3 討論

傳統(tǒng)心電圖檢查、心肌酶譜是AMI的重要診斷方法，但部分AMI患者心電圖早期表現(xiàn)不明顯，臨床鑒別診斷較困難，難達指南要求[7]。人類基因組測序結果表明，全基因組中70%～90%基因進行轉錄，僅不到2%基因最終翻譯為蛋白，這些不具有蛋白編碼功能的基因組序列曾一度被認為是“垃圾序列”，近年來隨研究深入，此“垃圾序列”被重視，其中l(wèi)ncRNA參與X染色體沉默、基因組印記與染色質(zhì)修飾等多種調(diào)控過程[8]。UCA1是lncRNA中調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育及癌癥發(fā)生發(fā)展與侵襲轉移的非編碼RNA[9]，研究表明UCA1基因高表達開始于受精后早期胚胎發(fā)育過程中，在不同器官中表達水平不同，多在膀胱癌、胚胎中表達上調(diào)，而成人組織中，UCA1僅在心臟及脾臟中表達，且在心臟中表達水平較高，提示UCA1可能作為一種潛在的心臟特異性標志物，為心血管疾病的診斷及治療提供更好方案[10]。有研究表明UCA1還可抑制膀胱癌細胞增殖，促進細胞凋亡，推測UCA1可能也在心臟保護中發(fā)揮重要作用[11]。

表1 AMI組、對照組血漿UCA1、CK-MB、cTnI水平比較[n，（±s），h]Table1 Comparison of plasma UCA1，CK-MB and cTnI levels between AMIgroup and controlgroup[n，（±s），h]

表1 AMI組、對照組血漿UCA1、CK-MB、cTnI水平比較[n，（±s），h]Table1 Comparison of plasma UCA1，CK-MB and cTnI levels between AMIgroup and controlgroup[n，（±s），h]

注：與同組入院后6～12h比較，*P＜0.05；與同組入院后12～24h比較，#P＜0.05。

指標UCA1表達入院后入院后入院后入院后入院后入院后入院后入院后CK-MB（U/L）入院后入院后入院后入院后入院后入院后入院后cTnI（ng/mL）入院后入院后入院后入院后入院后入院后組別0～22～6 6～1212～24 24～48 48～7272～960～22～6 6～1212～24 24～48 48～7272～960～22～6 6～1212～24 24～48 48～7272～96 AMI組（n=80）0.96±0.09a 0.61±0.08a 0.46±0.050.48±0.07a 0.95±0.06a 0.99±0.09a 1.03±0.15a 14.25±1.57a 54.23±5.65a 126.45±14.12112.14±13.48a 97.56±9.85* 86.54±8.77* 76.98±8.02* 0.31±0.04b 0.71±0.08b 3.60±0.38b 6.75±0.695.87±0.59b 5.43±0.56b 5.10±0.55b 對照組（n=30）1.02±0.111.02±0.111.02±0.111.02±0.111.02±0.111.02±0.111.02±0.1113.99±1.48 13.99±1.48 13.99±1.48 13.99±1.48 13.99±1.48 13.99±1.48 13.99±1.480.29±0.070.29±0.070.29±0.070.29±0.070.29±0.070.29±0.070.29±0.07 t值2.92621.50536.708 30.5134.2631.4630.3330.78538.416 43.41139.678 46.146 44.946 42.629 1.874 25.33347.27951.03551.51949.98547.621 P值0.0040.0000.0000.0000.0000.1460.7400.4340.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0640.0000.0000.0000.0000.0000.000

心肌酶譜中CK-MB可在AMI發(fā)生后4～6h升高，72 h恢復正常，而cTnI是存在于心肌細胞中的參與肌肉收縮的重要橫紋肌結構蛋白，心肌壞死后cTnI釋放入血，在心肌損傷4～6 h開始升高[12]。本研究中結果表明UCA1可能具有更高的診斷價值。

AMI組入院后整體UCA1表達水平先下調(diào)，后上調(diào)，且AMI組入院后0～48 h UCA1變化幅度與對照組比較差異顯著，這與Yan等[13]的報道結果相近，可見UCA1可能在維持AMI患者心臟功能過程中起著重要作用。但上述張濱[8]也報道AMI患者入院后48～72h內(nèi)患者UCA1仍較健康對照組下調(diào)，與上述不同的是，本研究中患者可能受研究對象年齡、地區(qū)、檢測方法等因素影響，在入院6～48 h UCA1呈明顯下調(diào)趨勢，提示此期AMI患者心肌細胞損傷較嚴重，而經(jīng)對癥治療后在48～96 h時復常，因此UCA1有望作為診斷AMI的潛在生物學標志物及治療潛在靶點[14]。關于UCA1的作用機制，既往Pa n等[15]的研究證實miR-1可能通過影響體內(nèi)有心肌保護作用的蛋白而加劇心肌損傷，體外實驗[16]發(fā)現(xiàn)過多表達的miR-1可促進H2O2誘導的心肌細胞凋亡，因此推測UCA1可能通過抑制miR-1表達來起到預防心肌損傷的作用。

表2 AMI組中合并不同疾病患者UCA1、CK-MB、cTnI表達水平比較[n，（±s）]Table2 Comparison of UCA1，CK-MB and cTnIexpression levels in patients with differentdiseases in the AMIgroup[n，（±s）]

表2 AMI組中合并不同疾病患者UCA1、CK-MB、cTnI表達水平比較[n，（±s）]Table2 Comparison of UCA1，CK-MB and cTnIexpression levels in patients with differentdiseases in the AMIgroup[n，（±s）]

是否合并基礎疾病合并不合并類型高血壓糖尿病高脂血癥合并2種及以上-n 34 21512329 UCA1表達水平0.47±0.080.49±0.090.51±0.100.47±0.070.48±0.05CK-MB（U/L）110.43±12.59 109.48±10.29 111.24±12.39 108.97±11.23110.18±11.69 cTnI（ng/mL）6.24±0.656.31±0.64 6.27±0.656.30±0.676.28±0.65

比較AMI中合并多種基礎疾病患者的UCA1水平，發(fā)現(xiàn)AMI組中單純AMI、合并高血壓、糖尿病、合并高脂血癥、合并2種及以上基礎疾病患者UCA1表達水平兩兩比較差異無顯著性，這與上述張濱[8]的研究結果相似，進一步明確了高血壓、糖尿病等基礎疾病對AMI患者UCA1表達無明顯影響，有利于提高UCA1診斷AMI的靈敏度、特異度。

圖1 UCA1、CK-MB、cTnI水平診斷AMI的ROC曲線Figure1 ROC curve of AMIdiagnosed by levels of UCA1，CK-MB and cTnI

ROC曲線分析表明，UCA1診斷AMI的ROC曲線下面積為0.954，與Yan等[17]學者的報道結果相近，但本研究也顯示入院后6～12hUCA1診斷AMI的靈敏度、特異度、準確度相比于CK-MB、cTnI較好，這與上述研究結果不同，考慮與研究中血漿樣本選取時間不同有關。國內(nèi)一項基于Logistic回歸和ROC曲線的綜合評價[18]結果發(fā)現(xiàn)，CK-MB、cTnI診斷早期AMI的靈敏度分別為62.1%、67.4%，準確度分別為75.5%、71.6%，可見CK-MB、cTn I對AMI診斷靈敏度嚴重不足，可能是因為在心梗發(fā)生后0～6 h內(nèi)CK-MB、cTnI尚未釋放入血，而UCA1則在發(fā)病后立即釋放入血。選擇AMI患者入院后6～12 h血漿進行分析，此期為患者UCA1表達下調(diào)期，患者心肌損傷可能是最嚴重的，因而UCA1變化最明顯，故對AMI的診斷價值較高。但在實際工作中也需注意檢測準確性，因入院后6～12 h血漿樣本量中UCA1表達量少，建議多次檢測后進行評估。

綜上所述，AMI患者發(fā)病后UCA1、CK-MB、cTnI表達水平發(fā)生明顯變化，其UCA1相比于傳統(tǒng)CK-MB、cTnI具有更高檢測價值，尤其在入院后6～12 h UCA1表達水平呈最低狀態(tài)，提示此期為最佳干預期，同時可將UCA1作為臨床潛在治療靶點。