血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白在AP患者中的變化及其意義

王長(zhǎng)起 李凱 索勝利

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）的發(fā)病率維持在（217～383）/1萬人左右[1]，在具有不良飲食習(xí)慣或者局部膽道系統(tǒng)疾病的人群中，AP的發(fā)病率進(jìn)一步的上升。AP的發(fā)生能夠?qū)е禄颊叨嗥鞴俟δ芩ソ叩陌l(fā)生，增加患者的臨床預(yù)后惡化的風(fēng)險(xiǎn)[2]。生物學(xué)因子的改變能夠?qū)е乱认賹?dǎo)管上皮細(xì)胞的損傷，增加腺體導(dǎo)管的張力，促進(jìn)胰消化酶對(duì)于自身組織的損傷。在胰腺導(dǎo)管破裂的過程中，淀粉酶的釋放能夠?yàn)樵缙谠\斷AP提供重要的參考，同時(shí)上升的淀粉酶還能夠參與到AP患者局部胰腺組織損傷和炎癥反應(yīng)的擴(kuò)散過程中[3]；C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）的上升能夠誘導(dǎo)下游單核細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞上調(diào)，促進(jìn)炎癥因子IL-8對(duì)于胰腺組織的浸潤(rùn)過程[4]；胱天蛋白酶募集域蛋白9（caspase recruitment domain protein 9，Card9）的上升能夠誘導(dǎo)炎癥信號(hào)通路的激活，參與到AP患者的病情進(jìn)展過程中[5]。為了揭示血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白在AP患者中的變化及其意義，本次研究探討了不同指標(biāo)的表達(dá)特點(diǎn)及其與患者病情的關(guān)系，從而為臨床上AP患者的診療提供定量化參考指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取南陽油田總醫(yī)院2014年6月至2016年12月確診的128例AP患者為AP組、年齡及性別相匹配的健康自愿者64例為對(duì)照組。AP組的年齡27～65歲，平均（39.9±11.5）歲，男性70例、女性58例，其中輕癥AP患者96例（Ranson評(píng)分＜3分）、重癥AP患者32例（Ranson評(píng)分≥3分），入院時(shí)AP患者的Ranson評(píng)分（1.59±0.72）分。對(duì)照組的年齡25～65歲，平均（41.4±14.0）歲，男性37例、女性27例。兩組研究對(duì)象的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①AP患者的診斷及病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《急性胰腺炎診治指南2014年版》標(biāo)準(zhǔn)[5]；②患者年齡范圍19～65歲；③患者入院后接受內(nèi)科治療；④入院后24 h內(nèi)完成本研究相關(guān)標(biāo)本的采集，本研究獲得研究對(duì)象或其家屬的知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①胰腺癌；②伴有其他部位惡性腫瘤；③伴有免疫性疾??；④伴有感染性疾??；⑤長(zhǎng)期酗酒、慢性肝腎功能疾病。

1.2 血尿淀粉酶、CRP檢測(cè)方法

清晨采集空腹靜脈血，1000r/min離心10min，分離采集上層血清，采集標(biāo)本后檢測(cè)血尿淀粉酶、CRP。采用全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)雅培i2000）及試劑盒，檢測(cè)試劑盒購自福建新大陸生物技術(shù)有限公司。

Ranson評(píng)分系統(tǒng)包括入院時(shí)的5項(xiàng)臨床指標(biāo)和48h的6項(xiàng)指標(biāo)，各項(xiàng)分別為1分，合計(jì)11分，評(píng)分在3分及以上時(shí)即為重癥胰腺炎（Severe acute pancreatitis，SAP）。

1.3 Card9蛋白的檢測(cè)

清晨采集空腹靜脈血5mL，加入Card9蛋白抗體，PBS液體洗滌5min。按照1∶500的比例加入羊標(biāo)志的一抗5mL，4℃放置過夜，PBS緩沖液洗滌3次，每次5min，加入鼠來源的二抗（1∶1000）2 mL，室溫放置2 h，PBS液體洗滌5min。加入顯色底物，辣根過氧化物酶會(huì)使無色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450nm處測(cè)OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)表述采用（±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)分析法；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組的血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白水平比較

入院后AP組患者的血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白水平均顯著的高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 不同病情程度的AP患者血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白水平比較

重癥AP組患者的血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白水平均顯著的高于輕癥AP組患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白與Ranson評(píng)分的相關(guān)性分析

128例AP患者，入院48h后Ranson評(píng)分為（2.11±0.80）分，血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白水平與Ranson評(píng)分均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），見表3。

表1 兩組的血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白水平比較[（n，（±s）]Table1 Comparison of blood urease amylase，CRPand Card9 protein levels in two groups[（n，（±s）]

表1 兩組的血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白水平比較[（n，（±s）]Table1 Comparison of blood urease amylase，CRPand Card9 protein levels in two groups[（n，（±s）]

組別AP組對(duì)照組t值P值n 128 64血淀粉酶（U/L）834.6±149.271.2±17.8 40.7360.000尿淀粉酶（U/L）2115.8±251.8 549.5±106.247.6400.000CRP（mg/L）94.0±26.9 3.2±1.2104.3570.000Card9蛋白（相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度）0.92±0.210.34±0.1120.7020.000

表2 不同病情程度的AP患者血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白水平比較[（n，（±s）]Table2 Comparison of serum amylase，CRPand Card9 protein levels in APpatients with differentdegrees of disease[n，（±s）]

表2 不同病情程度的AP患者血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白水平比較[（n，（±s）]Table2 Comparison of serum amylase，CRPand Card9 protein levels in APpatients with differentdegrees of disease[n，（±s）]

組別輕癥AP組重癥AP組t值P值n 96 32血淀粉酶（U/L）767.2±120.71044.2±142.8-10.7200.000尿淀粉酶（U/L）1839.5±239.62559.2±220.4-14.9980.000CRP（mg/L）81.5±21.4120.3±25.0-8.5090.000Card9蛋白（相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度）0.75±0.18 1.15±0.20-10.5850.000

表3 血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白與Ranson評(píng)分的相關(guān)性分析Table3 correlation analysisbetween serum and urine amylase，CRP，Card9 protein and Ranson score

3 討論

過度飲酒、膽道系統(tǒng)疾病及遺傳易感因素等，均可以促進(jìn)急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展，特別是在家族史的患者中，胰腺炎的發(fā)病率更高，可較普通人群上升3～4倍。胰腺炎特別是重癥胰腺炎的遠(yuǎn)期生存指標(biāo)較差，五年生存率不足35%，病死率可達(dá)15%以上[6]。通過早期進(jìn)行診斷，可以提高胰腺炎的病情緩解率，降低病死率，并改善遠(yuǎn)期臨床預(yù)后指標(biāo)。臨床上主要采用影像學(xué)檢查的方式進(jìn)行篩查，但影像學(xué)檢查難以在基層醫(yī)院廣泛普及，且檢查費(fèi)用相對(duì)較高、檢查時(shí)間較長(zhǎng)，臨床應(yīng)用具有一定的局限性。血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)具有方便、經(jīng)濟(jì)、短期內(nèi)可反復(fù)測(cè)量的優(yōu)點(diǎn)，在消化系統(tǒng)疾病的篩查中發(fā)揮了重要的作用。

CRP作為炎癥反應(yīng)蛋白家族成員，其能夠在促進(jìn)氧化應(yīng)激損傷或者加劇細(xì)胞膜的不穩(wěn)定性等方面發(fā)揮了重要作用，CRP蛋白還能夠通過影響細(xì)胞膜上鈣離子通道的開放，進(jìn)一步加劇胰腺組織的缺血再灌注損傷[7-8]；血尿淀粉酶的改變能夠評(píng)估患者體內(nèi)胰腺導(dǎo)管破裂損傷過程中自身消化酶的釋放情況，血尿淀粉酶的上升能夠在發(fā)病早期即可出現(xiàn)顯著的改變，同時(shí)在評(píng)估病情的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)方面能夠發(fā)揮一定的作用[9-10]；Card9蛋白的表達(dá)能夠誘導(dǎo)體內(nèi)的炎癥信號(hào)通路的激活，提高NF-KB的激活程度，增加MAPK信號(hào)通路激活過程中炎癥因子的合成和釋放[11-12]?；A(chǔ)領(lǐng)域相關(guān)的研究還顯示，Card9蛋白能夠影響誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的激活，促進(jìn)下游炎癥性細(xì)胞對(duì)于胰腺組織的浸潤(rùn)。目前臨床上多數(shù)研究探討了CRP或者血尿淀粉酶在AP患者中的高表達(dá)情況，認(rèn)為血尿淀粉酶或者CRP的上升與AP患者的病情密切相關(guān)，但對(duì)于Card9蛋白的分析研究較少。

本次研究分析了AP患者血清中相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白均明顯的上升，高于正常對(duì)照人群血清學(xué)指標(biāo)，提示了血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白均可能影響到AP的病情發(fā)生和進(jìn)展過程，薈萃國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，筆者認(rèn)為血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白的上升主要與下列幾個(gè)方面的因素有關(guān)[13-14]：①血尿淀粉酶的上升主要考慮與胰腺導(dǎo)管的破壞導(dǎo)致的自身消化酶的釋放有關(guān)；②CRP的上升主要由于自身組織損傷過程中誘導(dǎo)的炎癥因子的富集過程有關(guān)，消化酶對(duì)于自身胰腺組織的破壞和分解作用，能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞的激活，提高CRP的合成和釋放的速度；③Card9蛋白是重要的炎癥信號(hào)通路因子，其對(duì)于MAPK信號(hào)通路的激活，能夠誘導(dǎo)鈣離子負(fù)載效應(yīng)，增加胰腺上皮細(xì)胞膜完整性的破壞，并能夠誘導(dǎo)線粒體的損傷。王海等[12]研究者發(fā)現(xiàn)在AP中，CRP的上升幅度可超過28%，特別是在合并有自身基礎(chǔ)性疾病的AP患者，CRP的上升更為明顯，遠(yuǎn)期的多器官功能衰竭或者病死率均可進(jìn)一步的上升。在不同病情的AP患者中，病情較重的AP患者中，血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白均可進(jìn)一步的上升，提示了不同指標(biāo)與AP患者的病情密切相關(guān)，這主要由于在腹膜損傷、胰腺組織破壞和繼發(fā)性的炎癥瀑布反應(yīng)過程中，機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下的腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)可顯著的激活，巨噬細(xì)胞或者間質(zhì)細(xì)胞釋放CRP、Card9蛋白的速度可顯著的上升。但部分學(xué)者并未發(fā)現(xiàn)Card9蛋白的表達(dá)與AP患者的病情程度具有線性的關(guān)系，這可能與Card9蛋白的檢測(cè)時(shí)機(jī)或者AP病情的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的不一有關(guān)。AP的病情嚴(yán)重成分評(píng)分（Ranson評(píng)分）是評(píng)估患者預(yù)后的重要體系，相關(guān)關(guān)系分析可見，血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白水平與Ranson評(píng)分均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，提示了血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白與AP的病情具有一定的相關(guān)性。

本次研究的創(chuàng)新性在于探討了Card9蛋白的表達(dá)與AP患者的臨床病理特征的關(guān)系。綜上所述，AP患者血尿淀粉酶、CRP、Card9蛋白水平升高顯著，并且與病情的嚴(yán)重程度具有一定的相關(guān)性。