攜帶NDM-1基因合并膜孔蛋白OmpK36缺失肺炎克雷伯菌耐藥性分析

涂海健 黃亞雨 陳淑娟 許光輝

自從2009年Dongeun首例報道從印裔瑞士旅游者尿路感染標本中分離出攜帶產新德里金屬β-內酰胺酶（NewDelhimetallo-beta-lactamase 1，NDM-1）肺炎克雷伯菌，也被稱之“超級細菌”后，因產NDM-1型金屬β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌對青霉素類，一至四代頭孢菌素、碳青霉烯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等藥物高度的耐藥性已引起全球廣泛關注[1]。近來研究發(fā)現(xiàn)，NDM共17個基因突變體，主要由大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌、革蘭氏陰性非發(fā)酵菌、假單胞菌屬和鮑曼不動桿菌攜帶，NDM基因主要通過質粒在細菌屬內及屬間傳播[2-3]。我國多個城市都有產NDM型β-內酰胺酶耐藥菌報道，其中北京、上海、?？凇B門等一線和沿海城市陽性率較高，且檢出攜帶NDM基因菌逐年升高的趨勢，產NDM型β-內酰胺酶菌都是多重耐藥菌或為泛耐藥菌[4]。越來越多的數據表明產NDM型β-內酰胺酶耐藥菌已在全球范圍流行并引發(fā)多種類型感染，是威脅人類健康的主要公共衛(wèi)生問題之一[2]，及時準確了解產NDM型β-內酰胺酶菌耐藥機制、流行現(xiàn)狀和特點，是預防和控制產NDM耐藥菌感染的關鍵所在。本文對從前列腺增生患者尿液標本中分離出的1株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenemresistant klebsiella pneumoniae，CRKP），對其耐藥情況、分子多位點序列分型，攜帶耐藥基因、傳播方式，膜孔蛋白表達情況進行研究，旨在了解本地區(qū)攜帶NDM-1基因肺炎克雷伯菌耐藥、分子流行特點及耐藥機制，為臨床抗菌治療和醫(yī)院內感染控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

實驗菌為2017年分離自莆田學院附屬醫(yī)院泌尿外科前列腺增生患者尿液標本中分離出1株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌。質控標準菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、ATCC BAA-1706、大腸桿菌J53購置于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，ATCC25922，ATCC13883標準菌株購置于衛(wèi)計委臨床檢驗檢驗中心。

1.2 藥敏試驗、EDTA協(xié)同試驗、改良Hodge試驗

藥敏試驗實驗采用法國梅里埃公司VITEK 2 compact系統(tǒng)及配套GN-13藥敏卡進行藥敏MIC值檢測，對亞胺培南耐藥的菌株鑒定為耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌。EDTA協(xié)同試驗、改良Hodge試驗按文獻報道[5-6]進行。

1.3 多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）檢測

按MLST website（http：//www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/m lst/Kpneumoniae.htm l）要求對肺炎克雷伯菌的7個保守官家基因（gapA，infB，mdh，pgi，phoE，rpoB和t on B）設計引物（表1）進行PCR擴增，產物純化后上ABI 3730XL測序，結果用Polyphred軟件分析。

1.4 β-內酰胺酶相關耐藥基因和膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因檢測

提取靶基因用PCR技術擴增相關β-內酰胺酶基因和膜孔蛋白Omp K35、Omp K36基因，引物如表2所示，擴增后的產物，經2%瓊脂凝膠電泳后觀察結果。

表1 肺炎克雷伯菌的7個保守官家基因PCR及測序引物Table1 7PCR and sequencing primers for housekeeping genes of K lebsiella pneumoniae

表2 β-內酰胺酶相關耐藥基因和膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因擴增引物及片段Table2 Amplification primers and fragments of beta-lactamase-related drug resistance genes andmembrane porin OmpK35 and OmpK36 genes

1.5 NDM-1和OmpK35、OmpK36基因序列分析

取NDM-1和OmpK35、OmpK36基因PCR擴增產物，進行純化后用ABI3730XL進行測序，結果在Genbank網站上進行Bl as t分析。

1.6 采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測膜孔蛋白OmpK35、OmpK36

取20mL對數期生長的肉湯培養(yǎng)細菌進行超聲波破碎，采用超高速離心法提取膜蛋白，具體參數按文獻[7]進行，取20μg含膜孔蛋白懸液上膠進行SDS-PAGE電泳，最后經考馬斯亮藍染色并脫色后觀察結果。

1.7 質粒接合試驗

以產NDM-1肺炎克雷伯菌為供體菌，用耐疊氮鈉的大腸桿菌J53作為受體菌，各取0.5mL肉湯中培養(yǎng)的供體菌和受體菌混勻，后置于4 mL LB肉湯中35℃靜置過夜，取以上菌液涂布于含100μg/mL疊氮鈉和0.5μg/mL亞胺培南的MAC培養(yǎng)基進行篩選，對篩選出陽性菌即接合子用紙片瓊脂擴散法（Kirby-Bauer disc agar diffusion method，K-B）檢測3種碳青霉烯類藥物美羅培南、亞胺培南、厄他培南的抑菌大小以判斷其耐藥情況。美羅培南、亞胺培南、厄他培南藥敏紙片購置英國Oxiod公司。

2 結果

2.1 產NDM-1酶肺炎克雷伯菌耐藥情況及EDTA協(xié)同試驗、改良Hodge試驗結果

產NDM-1酶肺炎克雷伯菌對所有β-內酰胺類藥物包含加酶抑制劑及碳青霉烯類藥物耐藥，合并對氨基糖苷類、氟喹諾酮類藥物耐藥，表現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象具體見表3，EDTA協(xié)同試驗陽性、改良Hodge試驗陰性，見圖1。

圖1 改良Hodge試驗和EDTA協(xié)同試驗結果Figure1 Results of EDTA synergistic test and modified Hodge test

2.2 MLST基因分子分型結果

實驗菌檢測出的等位基因譜為gapA，1；infB，1；mdh，1；pgi，1；phoE，1；rpoB，1；和tonB，1；故該株MLST基因分子分型為ST 15型。

表3 產NDM-1酶肺炎克雷伯菌耐藥情況及EDTA協(xié)同試驗、改良Hodge試驗結果(μg/mL)Table3 Drug resistance of NDM-1-producing K lebsiella pneumoniae and results of EDTA synergistic testand modified Hodge test(μg/mL)

2.3 β-內酰胺酶基因和膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因檢測結果

該菌株PCR檢測出攜帶NDM-1、KPC及SHV基因，未檢測到VIM、IMP、OXA-48、GES、GIM基因；檢測出膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因。NDM-1陽性結果，如圖2所示。

圖2 NDM-1基因PCR擴增產物電泳結果Figure2 Electrophoresis results of NDM-1 gene amplified by PCR

2.4 NDM-1和OmpK35、OmpK36基因序列分析

PCR檢測NDM-1陽性的產物進行測序，結果見圖3，序列通過NCBIblast比對確認為目標序列；OmpK35、OmpK36基因序列比對后發(fā)現(xiàn)存正點突變及片段缺失的現(xiàn)象。

圖3 NDM-1基因PCR擴增產物經測序確認結果Figure3 The amplified products of NDM-1 gene by PCR were confirmed by sequencing

2.5 O mpK35、OmpK36膜孔蛋白SDS-PAGE電泳結果

膜孔蛋白SDS-PAGE電泳顯示泳帶分子量在34 kDa和43kDa之間，對照組顯示兩條泳帶OmpK36（38.7kDa）及OmpAk（36.0kDa），而攜帶NDM-1基因菌株標本只顯示一條泳帶OmpKA（36.0kDa），另一條Omp K36缺失，見圖4。

圖4 膜孔蛋白SDS-PAGE電泳結果Figure4 SDS-PAGE electrophoresis of membrane pore protein

2.6 質粒結合試驗及接合子藥敏鑒定結果

對篩選出陽性的大腸桿菌J53受體菌，用PCR擴增驗證發(fā)現(xiàn)經質粒結合試驗后受體菌攜帶有NDM-1基因；并且其對3種碳青霉烯類藥物美羅培南、亞胺培南、厄他培南的抑菌圈分別縮小3.1（31/10）倍、2.3（28/12）倍、5.3（32/6）倍，見圖5。

圖5 大腸桿菌J53接合試驗前后對碳青霉烯類藥抑菌比較Figure5 Comparison of bacteriostasis to carbapenems before and after conjugation test of Escherichia coli J53

3 討論

隨著碳青霉烯類藥物在臨床的普遍使用，細菌對其耐藥也日趨嚴重，目前認為細菌產碳青霉烯酶是產生耐藥的主要原因[8]，碳青霉烯酶是一類能水解碳青霉烯類藥物的β-內酰胺酶。NDM-1為含金屬的β-內酰胺酶，因產生此酶的細菌表現(xiàn)為對抗生素高度耐藥，所以其一經出現(xiàn)引起全球關注，給臨床抗感染提出嚴峻的考驗。

現(xiàn)在國內外產NDM-1細菌的報道越來越多，甚至有暴發(fā)流行的報道[9-10]，本研究的菌種是從前列腺增生患者尿液標本培養(yǎng)分離對亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌株，改良Hodge試驗陰性，而EDTA協(xié)同實驗為陽性；雖然改良Hodge試驗陰性，仍推測實驗菌為產金屬β-內酰胺酶的碳青霉烯類藥耐藥的肺炎克雷伯菌，有報道認為改良Hodge試驗檢測碳青霉烯酶敏感度、特異性低的缺點，易出現(xiàn)假陰性[11-12]，本例改良Hodge試驗陰性，可能也是該原因導致。進一步采用PCR對相關β-內酰胺酶基因檢測發(fā)現(xiàn)該菌除攜帶NDM-1基因外還攜帶KPC、SHV基因，NDM-1的基因經序列分析比對確認，最終認定實驗菌產NDM-1型金屬β-內酰胺酶。該菌株表現(xiàn)對所有β-內酰胺類藥物包含加酶抑制劑及碳青霉烯類藥物耐藥，僅對丁胺卡那霉素、復方新諾明敏感，呋喃妥因中介，臨床抗菌治療面臨嚴重的挑戰(zhàn)，所以應加強對該菌的認識和提高監(jiān)控能力顯得十分重要[13]。

肺炎克雷伯菌膜孔蛋白在細菌耐藥中起重要作用[14]，肺炎克雷伯菌除了主要的膜孔蛋白OmpK35、OmpK36外仍表達其他膜孔蛋白如OmpK37、OmpKA、PhoE和LamB等。不同的報道SDS-PAGE檢出膜孔蛋白成份存在差異，García-Sureda等[15]研究中檢測出OmpK36和LamB膜孔蛋白，同時認為LamB存在與Omp K36缺失相關；而意大利學者采用SDS-PAGE方法檢測出OmpK35、OmpK36、OmpKA以及變異的OmpK36V[16]。本研究采用SDS-PAGE電泳分析肺炎克雷伯菌膜孔蛋白陽性標準菌株ATCC13883及其他對照株，檢出膜孔蛋白OmpK36和OmpKA，但未檢出膜孔蛋白OmpK35，這與David等[17]的報道結果一致，未檢出膜孔蛋白OmpK35。也有報道認為MALDI-TOF MS和SDS-PAGE方法檢測肺炎克雷伯菌膜孔蛋白時敏感性不夠導致膜孔蛋白OmpK35易漏檢[18]。而攜帶NDM-1基因的實驗菌膜孔蛋白SDS-PAGE電泳只檢測到Omp KA，故認為實驗菌膜孔蛋白OmpK36缺失，進一步對其膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因進行序列分析發(fā)現(xiàn)存在點突變或片段缺失，認為這可能是導致膜孔蛋白OmpK36缺失的主要原因。攜帶NDM-1基因伴膜孔蛋白OmpK36缺失肺炎克雷伯菌株是本地區(qū)首次報道，表現(xiàn)多重耐藥特點。

MLST基因分子分型提示實驗菌為ST15型；而本院同時期其他耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌為ST11型，表明該時期我院耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌的主要流行株為ST11，這與國內相關報道[19]認為ST11是耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌的主要基因分子分型，而產NDM-1肺炎克雷伯菌MLST基因分子分型呈多樣化相一致；提示攜帶NDM-1基因菌株遺傳背景與醫(yī)院流行株差異大，為本院菌株突變而來的概率低，當然也不排除為不同種屬細菌通過質粒轉移接合等方式傳播而獲得NDM-1基因，本文沒有擴大菌種范圍進行分析，有待進一步深入研究確認。

報道認為NDM-1基因是以質粒的方式，可在同種或不同種細菌間傳播[20]。本研究通過質粒接合試驗顯示供體菌的NDM-1基因通過質粒傳導給受體菌，受體菌獲得NDM-1基因后從對碳青霉烯類藥物敏感性發(fā)生改變，表現(xiàn)為對3種碳青霉烯類藥物美羅培南、亞胺培南、厄他培南耐藥，證明了NDM-1基因以質粒方式傳播，也為阻遏攜帶NDM-1基因細菌之間傳導以免暴發(fā)性流行提供依據。