貝赫切特綜合征患者腸道菌群微生物宏基因組學(xué)分析

劉秀梅 張成偉 劉淼

貝赫切特綜合征（Behcet syndrome，BD），即白塞病，是一種可侵害人體皮膚、口腔、血管、肺等多個器官的全身免疫系統(tǒng)疾病，臨床以口腔潰瘍反復(fù)發(fā)生、葡萄膜炎、皮膚損害為特征，青壯年為多發(fā)群體，若不及時治療，可能會引起患者腸穿孔、失明，甚至死亡[1-2]。既往研究認(rèn)為，BD發(fā)生與自身炎癥反應(yīng)和遺傳因素有關(guān)[3]，而近期研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物異?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)T免疫細(xì)胞亞群參與BD等許多免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生[4]。宏基因組學(xué)是通過環(huán)境樣品構(gòu)建宏基因組文庫，研究環(huán)境樣品中所有微生物構(gòu)成及功能的新方法[5]。本研究采用宏基因高通量測序技術(shù)分析BD患者腸道微生物群改變，初步探討腸道微生物群改變在BD發(fā)生中的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2018年1月本院收治的BD患者18例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合BD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②均為活動期患者；③入組前1個月未服用相關(guān)藥物治療；④患者均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心血管疾病、糖尿病等其他全身疾病；②合并腫瘤者；③合并藥物相關(guān)性結(jié)腸炎、非特異性結(jié)腸炎、合并克羅恩病等腸道疾病。BD組中男性14例，女性4例，年齡21～55歲，平均（38.27±8.58）歲，身體質(zhì)量指數(shù)（Body Mass Index，BMI）：（18.57～26.93）kg/m2，平均（23.02±2.89）kg/m2。另選取本院性別、年齡、BMI相匹配的健康人群24例作為對照，其中男性19例，女性5例，年齡18～52歲，平均（36.61±8.02）歲，BMI：（18.34～27.11）kg/m2，平均（23.25±3.10）kg/m2。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及宏基因組DNA提取

留取所有受試者新鮮糞便，立即送到實驗室，在2 h內(nèi)進行宏基因組DNA提取。嚴(yán)格按照QIAamp FastDNA StoolMiniKit（北京博邁斯科技發(fā)展有限公司）說明書步驟完成糞便DNA提取，然后通過凝膠電泳檢測DNA完整性，Nano Drop微量紫外分光光度計（Thermo Scientific，美國）檢測DNA純度，采用Qubit熒光計（Life Technologies，美國）檢測DNA濃度。

1.2.2 文庫構(gòu)建及測序

取2.5μg樣品DNA于500μL打斷管中，加入0.1×TE溶液65μL，于超聲破碎儀（sonics，美國）中打斷，然后進行末端修復(fù)、連接接頭，將連接接頭產(chǎn)物濃縮30min，凝膠電泳后回收620bp大小的條帶，進行PCR擴增，擴增條件：95℃預(yù)變性30s，1個循環(huán)，95℃變性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，15個循環(huán)，72℃延伸5min，1個循環(huán)，4℃保存10min。PCR產(chǎn)物凝膠電泳后進行回收。向反應(yīng)管中加入4種dNTP（熒光標(biāo)記）、DNA聚合酶、擴增產(chǎn)物，每次循環(huán)摻入一種堿基，擴增過程中收集熒光信號；恢復(fù)3′端粘性后，再摻入第二種堿基，依次類推，獲得DNA片段序列。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)處理與基因比對

高通量測序所得數(shù)據(jù)去除接頭引物、去除Human序列、去除低質(zhì)量短讀碼框（reads），最終得到高質(zhì)量reads。具體方法：將含有Adaptor接頭序列污染、含有N堿基數(shù)目≥3的reads去除，截切序列3′端，將質(zhì)量值＜20的堿基，過濾截切后長度不足60%原長的reads去除；若樣品來源于宿主，盡可能找到與宿主親緣關(guān)系較近物種的基因組或宿主基因組，將含有宿主序列污染的reads去除。隨后將正常人與BD患者測序結(jié)果與人類腸道宏基因組進行比對。采用一致性＞90%的質(zhì)量控制，即錯比堿基數(shù)量不超過總堿基數(shù)的10%。

1.2.4 物種注釋

通過SOAPal igner2.21軟件將高質(zhì)量reads與NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）已知的微生物（細(xì)菌、病毒、真菌、古細(xì)菌）序列進行比對，在界門、綱、目、科、屬、種等各水平進行分類，并統(tǒng)計豐度。

1.2.5 物種LEf Se差異分析

組間群落差異分析（LDA EffectSize，LEf Se）對豐度差異的檢測是采用非參數(shù)秩和檢驗，能發(fā)現(xiàn)豐度差異明顯的菌群，用LDA表示物種豐度對差異的影響。

2 結(jié)果

2.1 基因集構(gòu)建

BD組插入片段平均長度為1892 bp，平均測得reads數(shù)為19837218，平均高質(zhì)量reads數(shù)占比95.16%。對照組插入片段平均長度為1956 bp，平均測得reads數(shù)為54673420，平均高質(zhì)量reads數(shù)占比95.73%。

2.2 BD患者與正常人細(xì)菌門類分布差異

BD患者與正常人的優(yōu)勢菌群主要是硬壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）。BD患者中Bacteroidetes占4.21%，遠(yuǎn)低于正常人，BD患者中Proteobacteria占42.80%，遠(yuǎn)高于正常人，詳見表1。

表1 BD患者與正常人細(xì)菌門類分布比較[n（%）]Table1 Comparison of distribution of bacterial phylum categoriesbetween BD patientsand normal people[n（%）]

2.3 BD患者與正常人腸道微生物屬種差異

BD患者與正常人胃腸道微生物在屬水平上有194個菌屬存在差異，在種水平上有887個菌種存在差異。覆蓋基因最多的前20種優(yōu)勢菌在種水平上分布差異見圖1，其中BD患者優(yōu)勢菌包括Collinsella Spp.、Bilophila spp.及Bacteroides spp.等，正常人優(yōu)勢菌包括Clostridium spp.、Roseburia spp.、Methanogens等。

圖1 BD患者與正常人胃腸道微生物在種水平上分布差異Figure1 Distribution of gastrointestinalmicrobes atspecies levelbetween BD patients and normal people

2.4 LEfSe分析腸道微生物種屬差異

LEfSe分析結(jié)果顯示，BD患者顯著富集菌包括Mitsuokella、Bacteroides、Clostridium、Bacteroides、Candidatus、Rikenella、Collinsella、Bilophila，正常人顯著富集菌包括Methanomethylophilus、Acidiphilium、Clostridium、Methanoculleus、Bacteroides、Roseburia、acteroides等，見圖2。

圖2 BD患者與正常人胃腸道微生物L(fēng)E f Se分析結(jié)果Figure2 LEfSe analysis results of gastrointestinalmicrobes between BD patients and normal people

3 討論

BD是一種受遺傳和環(huán)境因素影響的系統(tǒng)性血管疾病。腸道菌群作為一種宿主因子，近年來因其在BD發(fā)病機制中的潛在作用而受到廣泛關(guān)注[7]，但與BD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚未闡明。本研究采用宏基因組學(xué)方法分析BD相關(guān)腸道菌群微生物特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于正常人，在門水平上，BD患者腸道Proteobacteria增多，而Bacteroidetes減少；在屬種水平上，大部分BD患者優(yōu)勢菌屬于Proteobacteria，BD患者腸道富集菌還包括Collinsella Spp.、Bilophila spp.及Bacteroides spp.，大部分正常人優(yōu)勢菌屬于Bacteroidetes，如Clostridium spp.、Roseburia spp.、Methanogens.以上結(jié)果提示BD患者腸道微生物缺乏產(chǎn)甲烷菌、產(chǎn)丁酸菌，富集產(chǎn)乳酸菌、硫酸鹽還原菌，與Shimizu[9]以日本BD患者為研究對象，采用16 s RNA測序結(jié)果一致。但Consolandi[8]等人以意大利BD患者為研究對象，結(jié)果顯示，相對于正常人，BD患者Roseburia和Subdol igranulum菌屬相對豐度下降，丁酸鹽含量減少，與本研究結(jié)果稍有偏差，說明種族和地區(qū)可能會對BD患者腸道微生物改變造成影響。產(chǎn)乳酸菌Collinsella Spp.屬于革蘭陽性菌，謝佳[10]等人認(rèn)為乳酸菌可作為益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，有助于腸黏膜的修復(fù)，廣泛用于消化不良、便秘等消化道系統(tǒng)疾病治療。Liu[11]等人從類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和健康人糞便中提取細(xì)菌DNA，分析兩組腸道菌群的豐度、乳酸菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者糞便菌群中乳酸菌（10.62±1.72）拷貝/g明顯多于健康組（8.93±1.60）拷貝/g，RA患者在豐度、均勻度方面均有顯著增加，認(rèn)為乳酸菌群落與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展之間存在潛在關(guān)系。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生機制可能與乳酸菌肽聚糖生物學(xué)活性有關(guān)，肽聚糖作為乳酸菌細(xì)胞壁成分之一，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性或非特異性免疫反應(yīng)，并誘導(dǎo)產(chǎn)生抗炎或促炎細(xì)胞因子[12-13]。肽聚糖是Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）的配體，Liang[14]等人研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，活動期BD患者肽聚糖水平明顯增加，認(rèn)為TLR2信號通路可能與BD發(fā)病有關(guān)。結(jié)合本文研究結(jié)果，推測乳酸菌可能通過細(xì)胞壁的肽聚糖，激活TLR2信號通路而引發(fā)BD。

硫酸鹽還原菌Bilophila spp.在人體腸道內(nèi)廣泛存在，是以無機或有機化合物作為電子供體產(chǎn)生硫化氫的的的厭氧微生物。已有研究發(fā)現(xiàn)，其與結(jié)腸疾病的發(fā)生相關(guān)[15]。硫酸鹽還原菌作為革蘭陰性菌，可通過產(chǎn)生脂多糖誘發(fā)炎癥，另外，還能抑制丁酸鹽氧化，使丁酸鹽含量減少，而產(chǎn)丁酸菌Clostridium spp.和Roseburia spp.對腸上皮屏障具有保護作用，對機體免疫狀態(tài)具有維穩(wěn)作用，所以丁酸鹽的減少會引起腸上皮屏障受損，有助于致病分子入侵[16]。本研究認(rèn)為，BD的發(fā)生可能與硫酸鹽還原菌破壞腸上皮屏障、抑制丁酸鹽氧化有關(guān)。

綜上所述，Collinsella Spp.、Clostridium spp.和Roseburia spp.有利于機體免疫穩(wěn)態(tài)的維持，但腸道微生物過度生長的Bilophila spp.可能會打破這種平衡，使Collinsel laSpp.過度生長，而Clostridium spp.和Roseburia spp.生長抑制，從而損傷腸上皮細(xì)胞，促進脂多糖、肽聚糖等致病分子入侵腸上皮細(xì)胞，并通過TLR2信號通路引起T細(xì)胞亞群失調(diào)，引發(fā)BD。