基于Taqman熒光ARMS-PCR技術檢測CYP3A5基因多態(tài)性方法的建立

朱小亞 黃志文 蔣析文

人類CYP3A5基因位于第7號染色體，全長31.8 kb，包含13個外顯子，編碼的蛋白由502個氨基酸組成。CYP3A5野生型為CYP3A5*1，研究表明，攜帶CYP3A5*1等位基因的個體，CYP3A5蛋白表達水平及蛋白活性顯著高于純合突變型個體[1]。CYP3A5基因存在多個等位基因的突變，如CYP3A5*2、CYP3A5*3、CYP3A5*4、CYP3A5*5、CYP3A5*6等，其中，CYP3A5*3（A＞G，SNP登記號：rs776746）在各種族中發(fā)生突變頻率最高[2-6]。該等位基因位于第3內(nèi)含子69 86位核苷酸，當6 986位核苷酸突變?yōu)镚（CYP3A5*3）時可形成一個隱含的受體剪接位點，直接導致終止密碼子提前，使CYP3A5蛋白質(zhì)無法表達，最終使CYP3A5*3酶活性明顯降低甚至消失[7-8]。研究表明CYP3A5在他克莫司的代謝中有著重要作用，其活性降低可導致他克莫司的血藥濃度升高[9]。他克莫司（tacrolimus，F(xiàn)K506）為大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，臨床上廣泛用于肝、腎、心、肺、胰等器官移植患者的免疫抑制治療。器官移植患者應用他克莫司后血藥濃度偏低可導致急性排斥反應和藥物敏感性降低；血藥濃度偏高則容易發(fā)生腎毒性、神經(jīng)毒性、糖尿病、高血脂癥、高血壓和胃腸道紊亂等不良反應，導致他克莫司毒副作用的發(fā)生。CPIC指南建議攜帶CYP3A5*3/*3基因型的移植患者減少他克莫司的用藥劑量，以避免發(fā)生藥物不良反應。本研究基于Taqman熒光ARMS-PCR技術，建立一種CYP3A5*3基因多態(tài)性的檢測方法對于臨床指導器官移植患者服用他克莫司劑量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HotStart Taq Master Mix、2×Taq PCR Master Mix（購自天根生化科技（北京）有限公司；DL1000DNA Marker、CYP3A5*1/*1型、CYP3A5*3/*3型人工合成質(zhì)粒（購自生工生物工程（上海）股份有限公司）；核酸提取或純化試劑（磁珠法）（貨號：DA0643）（由本公司提供）；ABI7500Real-time PCR儀、Nanodrop2000超微量分光光度計（均購自美國Thermo Scientific公司）；水平電泳儀（購自北京六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（購自美國eAlpha Innotch公司）。

1.2 臨床樣本

200例乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝外周全血樣本由廣州達安臨床檢驗中心有限公司提供。

1.3 引物與探針

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的CYP3A5*3（rs776746）等位基因序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？do_not_redirect&rs=rs776746）及內(nèi)參基因GAPDH的序列（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/AY340484.1？report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=86&RID=M24C6HSE01N；GeneBank序列號：AY340484.1），采用Primerpremier5.0設計Taqman熒光PCR特異性擴增引物和探針，產(chǎn)物長度為80～150bp左右。為了提高ARMS-PCR引物的特異性，在CYP3A5*3和CYP3A5*1檢測上游引物3′端SNP位點的臨近位置引入錯配核苷酸，如表1中加粗斜體字母所示。檢測CYP3A5*3等位基因的Taqman探針5′端采用FAM熒光報告基團進行標記，3′采用BHQ1熒光淬滅基團進行標記。檢測內(nèi)參基因GAPDH的Taqman探針5′端采用VIC熒光報告基團進行標記，3′端采用BHQ1熒光淬滅基團進行標記。同時采用Primer premier 5.0設計CYP3A5*3的金標準Sanger測序引物，產(chǎn)物長度為300～400bp。引物和探針均由上海生工生物股份有限公司合成。具體序列特征和探針標記見表1。

1.4 全血樣本基因組DNA提取

采用中山大學達安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法），按試劑盒說明書進行操作。提取后的核酸置于-20℃冰箱中保存，并通過分光光度計測定其濃度。

1.5 Taqman熒光ARMS-PCR法檢測CYP3A5*1和CYP3A5*3體系的建立

1.5.1CYP3A5*1PCR反應體系

25μLCYP3A5*1PCR反應體系包含0.1μLCYP3A5*1上游引物（50μmol/L）、0.1μLCYP3A5共用下游引物（50μmol/L）、0.1μLCYP3A5共用探針（25μmol/L）、0.1μLGAPDH上游引物（50μmol/L）、0.1μLGAPDH下游引物（50μmol/L）及0.1μLGAPDH探針（25μmo l/L）。12.5μL2×Hot-Start Taq Master Mix、5μL DNA模板（分別為CYP3A5*1/*1型人工合成質(zhì)粒，CYP3A5*3/*3型人工合成質(zhì)粒，人類基因組DNA），6.9μL滅菌蒸餾水。反應擴增條件：95℃3min；94℃15s，55℃35s；40個循環(huán)。

表1 引物及探針序列表Table1 Sequences of primers and probes

1.5.2CYP3A5*3PCR反應體系

25μLCYP3A5*3PCR反應體系包含0.1μLCYP3A5*3上游引物（50μmol/L）、0.1μLCYP3A5共用下游引物（50μmol/L）、0.1μLCYP3A5共用探針（25μmol/L）、0.1μLGAPDH上游引物（50μmol/L）、0.1μLGAPDH下游引物（50μmol/L）及0.1μLGAPDH探針（25μmo l/L）。12.5μL2×Hot-Start Taq Master Mix、5μL DNA模板（分別為CYP3A5*1/*1型人工合成質(zhì)粒，CYP3A5*3/*3型人工合成質(zhì)粒，人類基因組DNA），6.9μL滅菌蒸餾水。反應擴增條件：95℃3min；94℃15s，55℃35s；40個循環(huán)。

1.5.3CYP3A5*1和CYP3A5*3測序體系的建立

25μL PCR反應體系包含0.1μLCYP3A5測序上游引物（50μmol/L）、0.1μLCYP3A5測序下游引物（50μmol/L）、12.5μL 2×Taq PCR Master Mix、5μL DNA模板（分別為CYP3A5*1/*1型人工合成質(zhì)粒，CYP3A5*3/*3型人工合成質(zhì)粒，人類基因組DNA）、7.3μL滅菌蒸餾水。反應擴增條件：95℃10min；94℃15s，60℃30s，72℃30s；40個循環(huán)。擴增結束后，取5μL PCR產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，并在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。將剩余PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，采用Bio-edit分析軟件比對分析測序結果與目的序列的一致性。

1.6 全血臨床樣本檢測

采用本研究所建立的體系對200例全血臨床樣本進行PCR檢測及測序驗證，分析兩種方法的一致性，統(tǒng)計分析CYP3A5*3基因多態(tài)性的分布。

2 結果

2.1 Taqman熒光ARMS-PCR法檢測CYP3A5*1、CYP3A5*3體系的建立

配制CYP3A5*1檢測體系，對CYP3A5*1/*1型、CYP3A5*3/*3型人工合成質(zhì)粒及攜帶CYP3A5*1型人類基因組DNA進行檢測。檢測CYP3A5*1/*1型人工合成質(zhì)粒，F(xiàn)AM通道擴增曲線呈S型，曲線光滑，Ct值＜35，VIC通道無明顯擴增曲線（圖1A）；檢測CYP3A5*3/*3型人工合成質(zhì)粒，F(xiàn)AM和VIC通道均無明顯擴增曲線（圖1B）；檢測10ng/μLCYP3A5*1/*3型人類基因組DNA，F(xiàn)AM通道和VIC通道擴增曲線呈S型，曲線光滑，Ct值為28左右（圖1C）。

配制CYP3A5*3檢測體系，對CYP3A5*1/*1型、CYP3A5*3/*3型人工合成質(zhì)粒及CYP3A5*1/*3型人類基因組DNA進行檢測。檢測CYP3A5*1/*1型人工合成質(zhì)粒，F(xiàn)AM和VIC通道均無明顯擴增曲線（圖2A）；檢測CYP3A5*3/*3型人工合成質(zhì)粒，F(xiàn)AM通道擴增曲線呈S型，曲線光滑，Ct值＜35，VIC通道無明顯擴增曲線（圖2B）；檢測10ng/μLCYP3A5*1/*3型人類基因組DNA樣本，F(xiàn)AM通道和VIC通道均有明顯擴增曲線，VIC通道擴增曲線呈S型，曲線光滑，Ct值為28左右（圖2C）。

2.2 CYP3A5測序PCR擴增體系的建立

配制CYP3A5測序PCR反應體系，對CYP3A5*1/*1型、CYP3A5*3/*3型和人類基因組DNA進行檢測。PCR擴增完成后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，根據(jù)有無條帶，條帶大小初步篩選出PCR擴增體系，結果如圖3所示，擴增條帶為300bp左右，與目的片段大小一致。將條帶大小一致的剩余反應產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。Bio-edit比對分析測序結果與目的序列一致，測序峰圖良好，各堿基信號值較強，多態(tài)性位點及臨近片段無雜峰、套峰等現(xiàn)象，且背景信號較低（圖4），表明CYP3A5測序PCR體系良好。

圖1 CYP3A5*1反應體系檢測結果Figure1 Detection results of CYP3A5*1 reaction system

圖2 CYP3A5*3反應體系檢測結果Figure2 Detection results of CYP3A5*3 reaction system

圖3 CYP3A5 PCR產(chǎn)物電泳圖Figure3 Agarose gelelectrophoresis of CYP3A5 PCR products

圖4 CYP3A5 PCR產(chǎn)物測序峰圖Figure4 Sequencing peakmap of CYP3A5 PCR products

2.3 臨床樣本檢測及多態(tài)性分析

提取200例外周血樣本基因組DNA，進行CYP3A5基因多態(tài)性檢測，并采用金標準sanger測序法進行驗證。結果顯示，本研究建立的基于Taqman熒光ARMS-PCRCYP3A5*1和CYP3A5*3體系與測序法有較好的一致性，所有樣本型別檢測結果完全一致。具體型別分布為：CYP3A5*1/*119例（9.5%），CYP3A5*1/*362例（31%），CYP3A5*3/*3119例（59.5%），CYP3A5*3等位基因突變頻率為75%。

3 討論

CYP3A5基因多態(tài)性是造成個體間CYP 3A活性差異（相差約l0～40倍）及CYP3A代謝藥物療效和個體間不良反應差異的最重要因素[10-12]。大量研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A5*3基因多態(tài)性是影響器官移植受體他克莫司（FK506）血藥濃度的重要因素[13-15]。CYP3A5在他克莫司的代謝中起重要作用，其活性降低可導致他克莫司的血藥濃度升高，不良反應增加。同時研究發(fā)現(xiàn)攜帶野生CYP3A5*1型患者需要比CYP3A5*3/*3型高2倍的劑量才能達到目標血藥濃度[16-17]。

目前常用的用于檢測CYP3A5基因多態(tài)性的方法包括DNA測序法（DNA sequencing analysis）、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、高效液相色譜分析（High performance liquid chromatography，HPLC）、毛細管電泳法（Capillary Electrophoresis，CE）等，但這些方法均存在操作復雜、耗時較長、成本高、檢測靈敏度低且容易造成假陽性或假陰性等弊端[18-20]。另外，傳統(tǒng)ARMS-PCR也被廣泛用于CYP3A5*3基因多態(tài)性檢測，雖然特異性較強，檢測靈敏度較高，但檢測過程涉及到瓊脂糖凝膠電泳等過程，操作復雜且需要接觸到EB染料等強致癌物，對人造成一定危害[21]。本研究基于Taqman熒光ARMSPCR技術，設計特異性引物，并在靠近引物3′端不同位置引入錯配堿基，篩選出最優(yōu)引物，對靶序列進行高精準PCR擴增放大，與此同時，利用探針對擴增產(chǎn)物進行檢測，在實時熒光定量PCR平臺上實現(xiàn)對樣品CYP3A5多態(tài)性的檢測。其檢測過程簡單快捷，僅需1個小時即可完成所有檢測，有效避免接觸EB染料，同時保證較高特異性和靈敏度。在200例臨床樣本檢測中，本方法檢測結果和金標準sanger測序法一致性為100%，表明其準確性較高。

因此，本研究建立的基于Taqman熒光ARMSPCR技術檢測CYP3A5基因多態(tài)性方法具有較高的準確性、特異性和靈敏度，且其操作簡便快速、自動化程度高、結果判讀直觀，在指導器官移植患者服用他克莫司藥物治療的起始劑量中具有良好的臨床應用前景，便于臨床的推廣。