耳聾基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品的研制

于婷 孫楠 曲守方 黃杰

分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，在我國(guó)最常見(jiàn)的四個(gè)耳聾基因是GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和線粒體12S rRNA基因。GJB2基因是中國(guó)人群中常見(jiàn)的非綜合征性耳聾致病基因，其中235delC是GJB 2基因常見(jiàn)的突變形式。GJB 3基因突變可以引起常染色體顯性或者隱性遺傳性非綜合征型耳聾。SLC26A4基因上IVS7-2A＞G突變是中國(guó)人大前庭水管綜合征中的熱點(diǎn)突變。線粒體上的1555A＞G突變與氨基糖甙類抗生素所致的聽(tīng)力下降密切相關(guān)。臨床上采用聽(tīng)力篩查與基因檢測(cè)相結(jié)合的方法[1]，有助于早期發(fā)現(xiàn)耳聾型高?；颊?，通過(guò)及時(shí)干預(yù)與治療以降低高危人群的發(fā)病率。

目前在臨床上，耳聾基因突變檢測(cè)的應(yīng)用已經(jīng)越來(lái)越普遍，并且隨著二胎計(jì)劃及國(guó)人對(duì)優(yōu)生優(yōu)育認(rèn)識(shí)程度的增加，該檢測(cè)項(xiàng)目將會(huì)在更大范圍推廣應(yīng)用。由于現(xiàn)有耳聾基因檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法多種，包括微陣列芯片法、飛行時(shí)間質(zhì)譜法、聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法、熒光PCR法等，如何評(píng)價(jià)這類試劑盒的性能指標(biāo)，保障臨床樣本檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、有效性。采用耳聾基因突變參考品進(jìn)行驗(yàn)證是一個(gè)比較直接的辦法。中國(guó)食品藥品檢定研究院2016年起開(kāi)始研制耳聾基因突變檢測(cè)性能評(píng)估的國(guó)家參考品，涵蓋上述4個(gè)耳聾基因20個(gè)堿基位點(diǎn)，為相關(guān)試劑盒的注冊(cè)檢測(cè)及臨床檢驗(yàn)室間質(zhì)評(píng)等提供可靠的參考品。

1 材料與方法

1.1 樣本

血樣來(lái)自濟(jì)寧婦幼保健院、天津華大臨檢中心、紹興市婦幼保院、北京301醫(yī)院和臺(tái)州醫(yī)院。

1.2 驗(yàn)證試劑

十五項(xiàng)遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測(cè)試劑盒（微陣列芯片法）購(gòu)自北京博奧生物有限公司；二十項(xiàng)遺傳性耳聾基因突變檢測(cè)試劑盒（飛行時(shí)間質(zhì)譜法）購(gòu)自廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司；耳聾基因突變檢測(cè)試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法）購(gòu)自華大生物科技（武漢）有限公司；耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒（PCR+導(dǎo)流雜交法）購(gòu)自潮州凱普生物化學(xué)有限公司；先天性耳聾基因檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）、藥物性耳聾基因檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）和PDS基因檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）均購(gòu)自濟(jì)南英盛生物技術(shù)有限公司；4項(xiàng)耳聾基因檢測(cè)試劑盒（ARMS-PCR法）購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。

1.3 主要檢測(cè)儀器

晶芯?LuxScan?10K-B微陣列芯片掃描儀（北京博奧生物有限公司生產(chǎn)并提供）、DR MassARRAY飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)并提供）、BGISEQ-500基因測(cè)序儀（華大生物科技（武漢）有限公司生產(chǎn)并提供）、HB 2012A導(dǎo)流雜交儀（潮州凱普生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)并提供）、ABI 7300熒光PCR儀（美國(guó)ABI生產(chǎn)，濟(jì)南英盛生物技術(shù)有限公司提供）、Bio-Rad S1000PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)，中生北控生物科技股份有限公司提供）。

1.4 方法

1.4.1 樣本篩選及采集

根據(jù)目標(biāo)檢測(cè)的4個(gè)基因（GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12SrRNA）的20個(gè)位點(diǎn)（GJB2基因的c.235delC、299_300del AT、c.35delG、c.176_191del 16突變，GJB3基因的c.538 C＞T、c.547G＞A突變，SLC26A4基因上的IVS7-2A＞G、c.2168 A＞G、c.1174 A＞T、c.1229 C＞T、c.1226G＞A、c.1975G＞C、c.2027T＞A、c.2162 C＞T、c.281C＞T、c.589 G＞A、IVS15+5G＞A突變，及線粒體12S rRNA基因的1095T＞C、1494C＞T和1555A＞G突變）的序列設(shè)計(jì)了10對(duì)PCR擴(kuò)增引物，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行PCR反應(yīng)，將獲得的基因擴(kuò)增片段進(jìn)行Sanger測(cè)序。確認(rèn)為野生型或突變類型后，按照臨床外周血采集方法，采用EDTA抗凝真空采血管采集滿足要求的外周血（30mL/人），于-80℃保存。本研究的臨床基本信息收集和臨床血樣的采集均獲得了患者或其家屬的同意，并簽署了知情同意書(shū)。

1.4.2 國(guó)家參考品制備

將含野生型或突變型耳聾基因的外周血樣本置于室溫融化后混勻，取50μL血液樣本滴加到903濾紙上，血液均勻擴(kuò)散為圓形，形成血斑，自然晾干呈深褐色后，封裝入含有干燥劑的密封袋內(nèi)，并貼上標(biāo)簽?；靹蛉獣r(shí)應(yīng)盡量輕柔，以減少溶血。每次僅制備一個(gè)樣本的干血片，以防樣本間混淆。樣本編號(hào)一一核對(duì)，干血片組裝為兩人復(fù)核，保證組裝正確。因部分耳聾基因突變樣本未收集到，暫時(shí)采用DNA樣本，用Tris緩沖液稀釋后進(jìn)行分裝，25μL/支。

1.4.3 參考品驗(yàn)證

采用6個(gè)廠家8個(gè)試劑盒對(duì)參考品進(jìn)行耳聾基因突變位點(diǎn)的驗(yàn)證，這些試劑包含6種檢測(cè)原理，各家檢測(cè)范圍不完全一致。根據(jù)各企業(yè)說(shuō)明書(shū)要求，對(duì)每份樣本提取的DNA及稀釋至1ng/μL的DNA進(jìn)行檢測(cè)，若1ng/μL濃度的DNA樣本未能檢出相關(guān)的突變位點(diǎn)，則按照企業(yè)說(shuō)明書(shū)聲稱的檢測(cè)限濃度進(jìn)行復(fù)測(cè)。對(duì)于檢測(cè)結(jié)果，要求應(yīng)檢出試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的突變位點(diǎn)；檢測(cè)范圍外的突變位點(diǎn)結(jié)果應(yīng)為野生型。

1.4.4 國(guó)家參考品穩(wěn)定性和均勻性驗(yàn)證

隨機(jī)取4套參考品，分別于37℃放置1、2、3、4周后，采用聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，上述穩(wěn)定性數(shù)據(jù)同時(shí)作為均勻性數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 參考品組成

共篩選出18個(gè)位點(diǎn)突變陽(yáng)性的臨床樣本及3例陰性樣本（上述20個(gè)位點(diǎn)均為野生型）。因SLC26A4基因的1229位點(diǎn)（19號(hào)樣本）和線粒體1494位點(diǎn)（20號(hào)樣本）突變的陽(yáng)性樣本未收集到，只能采用DNA樣本，用Tris緩沖液稀釋后進(jìn)行分裝，25μL/支，最終形成23份/套的耳聾基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品，具體樣本信息表詳見(jiàn)表1。

表1 耳聾基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品樣本信息表Table1 The information list of the national reference material of detection of deafness gene mutations

2.2 國(guó)家參考品驗(yàn)證結(jié)

對(duì)于試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的突變位點(diǎn)，大部分試劑盒均能檢出樣本的突變位點(diǎn)，但以下樣本，出現(xiàn)雙突變位點(diǎn)或三突變位點(diǎn)情況：P4，除已知突變位點(diǎn)外，多數(shù)試劑還檢出299_300del AT；P10、P11、P17，除已知突變位點(diǎn)外，多數(shù)試劑還檢出IVS7-2雜合突變；P19情況最復(fù)雜，各家結(jié)果不一，廠家1和廠家5-2除已知突變位點(diǎn)外，還檢出IVS7-2雜合突變，廠家2僅檢出已知突變，經(jīng)其測(cè)序驗(yàn)證無(wú)SLC26A4：IVS7-2A＞G。廠家3采用2種方法通過(guò)2次試驗(yàn)，均檢出c.1229C＞T雜合突變，但I(xiàn)VS7-2A＞G位點(diǎn)在不同檢測(cè)濃度檢測(cè)結(jié)果不一致：采用測(cè)序法，P19樣本DNA原濃度未檢出，稀釋至1ng/μL后可檢出，詳見(jiàn)表2；當(dāng)采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法，均出現(xiàn)IVS7-2突變堿基峰，但低于野生型峰。廠家4采用的是PCR+導(dǎo)流雜交法，檢出了3個(gè)位點(diǎn)突變情況，包括1229M雜合突變、IVS-M雜合突變以及299M雜合突變。廠家5-1、5-3以及廠家6，1229C＞T和IVS7-2A＞G均不在其檢測(cè)范圍內(nèi)，均表現(xiàn)為野生型；對(duì)于P9、P14、P16，廠家4檢出了1555突變，但經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證均無(wú)1555突變。

表2 廠家3采用測(cè)序法測(cè)定的P19樣本SLC26A4基因IVS7-2A＞G突變位點(diǎn)結(jié)果Table2 Results of IVS7-2A＞Gmutation site of SLC26A4 gene in P19 sample determined bymanufacturer 3 with sequencingmethod

對(duì)于不同檢測(cè)濃度樣本，大部分廠家的試劑均可檢出，僅廠家6在檢測(cè)1ng/μL濃度的參考品樣本時(shí)，部分未檢出，按照試劑盒的檢出限稀釋樣本至5ng/μL時(shí)，可檢出。

最終：本批次國(guó)家參考品協(xié)作驗(yàn)證的全部結(jié)果匯總見(jiàn)下表3。

表3 耳聾基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品驗(yàn)證結(jié)果匯總表Table3 The summary of validation results for the national reference material of detection of deafness gene mutations

2.3 參考品穩(wěn)定性結(jié)果

對(duì)37℃放置1、2、3、4周后的參考品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該4套參考品的突變位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果與該公司檢測(cè)正常保存樣本結(jié)果一致。后在使用過(guò)程中，將定期對(duì)該國(guó)家參考品進(jìn)行期間核查及長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究。

2.4 國(guó)家參考品各位點(diǎn)匯總及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確定

通過(guò)6個(gè)廠家8個(gè)試劑盒的驗(yàn)證，最終確認(rèn)耳聾基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品中：N1～N3未檢測(cè)到以上20個(gè)突變位點(diǎn)。P4增加c.176_191del16位點(diǎn)缺失突變，P10、P11和P17增加IVS7-2A＞G位點(diǎn)突變，P20增加c.235delC缺失突變。各家對(duì)P19樣本中的IVS7-2A＞G位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果存在一定爭(zhēng)議，分析可能存在雜合突變或者樣本被污染。最終P19定為：若c.1229C＞T為試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的位點(diǎn)，可僅檢出該突變。不對(duì)IVS7-2 A＞G缺失突變作要求。此外，因P19和P20樣本未采集到血樣，采用的是DNA參考品，各家測(cè)定濃度差異較大。因此在實(shí)際檢測(cè)之前，需對(duì)兩樣本的DNA濃度進(jìn)行測(cè)定，若濃度低于試劑盒聲稱的檢測(cè)限，允許檢測(cè)范圍內(nèi)的位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為野生型。

通過(guò)以上結(jié)果確認(rèn)采用此套參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的位點(diǎn)應(yīng)檢出；檢測(cè)范圍外的位點(diǎn)應(yīng)為野生型。DNA參考品（P19和P20）濃度若低于試劑盒聲稱的檢測(cè)限，允許檢測(cè)范圍內(nèi)的位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為野生型。P19參考品，若1229 C＞T為試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的位點(diǎn)，可僅檢出該突變。

3 討論

耳聾是人類最常見(jiàn)的感覺(jué)缺陷型疾病之一。耳聾的致病因素主要有環(huán)境因素、遺傳因素，或二者共同存在，據(jù)報(bào)道有超過(guò)65%的耳聾是由遺傳缺陷引起的[2-5]。我國(guó)每年新增約30000例先天性耳聾患兒[6]。大部分為重度、極重度感音神經(jīng)性耳聾，這嚴(yán)重影響了患者的交流和認(rèn)知能力，也對(duì)個(gè)人、家庭及社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)和生活負(fù)擔(dān)，所以耳聾早期診斷、早期干預(yù)和早期治療的工作非常重要。

目前已有注冊(cè)證的各類耳聾基因突變檢測(cè)試劑盒有多種[7-12]，因其方法原理不盡相同，試劑盒的準(zhǔn)確性、特異性、檢測(cè)限等性能必然有所差異，這些差異會(huì)不會(huì)對(duì)臨床結(jié)果有影響？有效評(píng)價(jià)方法之一，就是建立耳聾基因突變檢測(cè)參考品。根據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)）精神，將“組織體外診斷試劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品的制備和標(biāo)定工作”的責(zé)任主體明確為中檢院，以及參考上述研究背景，我院開(kāi)展了耳聾基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品的研制工作。通過(guò)分子流行病學(xué)調(diào)研，采集了我國(guó)最常見(jiàn)的耳聾基因?yàn)镚JB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和線粒體12S rRNA基因相關(guān)突變位點(diǎn)陽(yáng)性的外周血，制備成國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。6個(gè)廠家8個(gè)試劑盒的協(xié)作驗(yàn)證，大部分參考品的各突變位點(diǎn)均能被檢出，而且部分參考品還檢出了新的突變位點(diǎn)。一方面表明國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品適用性良好，另一方面，新突變位點(diǎn)的檢出應(yīng)是受限于所選用的方法和現(xiàn)有的認(rèn)識(shí)，在研制的時(shí)候，不一定能完全給出其全部突變位點(diǎn)信息，通過(guò)協(xié)作驗(yàn)證，使得參考品的突變位點(diǎn)信息更為完善。驗(yàn)證過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)存在一些問(wèn)題，某檢測(cè)試劑在多個(gè)參考品中檢出了12SrRNA的1555A＞G位點(diǎn)的突變，而測(cè)序結(jié)果表明無(wú)該位點(diǎn)突變。這就需要該檢測(cè)試劑廠家主動(dòng)找原因進(jìn)行分析，是試驗(yàn)過(guò)程中污染還是試劑設(shè)計(jì)問(wèn)題？對(duì)于3個(gè)陰性樣本（N1～N3），限于目前技術(shù)原因和認(rèn)識(shí)水平，目前只確認(rèn)此20個(gè)突變基因位點(diǎn)為野生型，但不排除有其他突變基因位點(diǎn)存在，這個(gè)將隨著參考品在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中及時(shí)進(jìn)行更新。

從DNA測(cè)序技術(shù)應(yīng)用在遺傳性耳聾的分子病因檢測(cè)以來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)220個(gè)耳聾基因[13]，而且最新的遺傳信息學(xué)表明，與遺傳性聾相關(guān)的基因達(dá)300～500個(gè)[14]。但多數(shù)相關(guān)基因突變所致的發(fā)病率并不高，因此要制備數(shù)量如此多的以全血為基質(zhì)的耳聾基因國(guó)家參考品盤(pán)，必然是一個(gè)耗時(shí)和昂貴的工程。但就目前來(lái)說(shuō)，這套國(guó)家參考品突變位點(diǎn)雖僅為20個(gè)常見(jiàn)突變位點(diǎn)，但也基本涵蓋了市場(chǎng)上所有具有注冊(cè)證的耳聾基因突變檢測(cè)試劑盒所檢測(cè)的突變位點(diǎn)類型，可以滿足評(píng)價(jià)現(xiàn)階段各試劑盒基本性能的要求，并且將在今后根據(jù)需要逐步擴(kuò)充新的耳聾基因突變位點(diǎn)。這套參考品必將為我國(guó)耳聾的早期防治工作發(fā)揮重要的作用。