復(fù)方山楂煎劑對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠模型的影響*

李 月 李 想

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,沈陽(yáng) 110032)(2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院、遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽(yáng) 110042)

脂肪肝是指由于各種原因引起脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)堆積的病變[1]。脂肪肝正嚴(yán)重威脅人類的健康，成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，脂肪肝已被公認(rèn)為隱蔽性肝硬化的常見(jiàn)原因。脂肪肝是一種常見(jiàn)的臨床現(xiàn)象，而非一種獨(dú)立的疾病，其臨床表現(xiàn)輕者無(wú)癥狀，重者病情嚴(yán)重。一般而言脂肪肝屬可逆性疾病，早期診斷并及時(shí)治療?？苫謴?fù)正常[2]。復(fù)方山楂煎劑組成：山楂50 g，延胡索15 g，丹參30 g，菊花15 g，紅花15 g，麥芽40 g。用法：每日1劑，文火煎至300 mL，分3次口服，其功能主治為：活血行氣，化濁散瘀，用于治療高脂血癥、脂肪肝及冠心病等[3]，有研究表明復(fù)方山楂煎劑治療高血脂癥30例,療效滿意,可顯著降低患者血清總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)含量[4-5]。在此我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察復(fù)方山楂煎劑對(duì)非酒精性脂肪肝的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g, 購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。大鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(遼)2014-0004。溫度：22～25 ℃,濕度：55%～60%。

1.2 藥品和試劑

復(fù)方山楂煎劑(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供,批號(hào)20170804)；脂必妥片(成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)20170319)；丙基硫氧嘧啶(上海復(fù)星朝輝藥業(yè)有限公司，批號(hào)20161208)；膽酸鈉(中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)F20170428)；膽固醇(上海如吉生物科技發(fā)展公司，批號(hào)20160622)；豬油市售；TG試劑盒(購(gòu)自長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20170409)； ALT、AST、MDA、SOD、試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)20170831)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor，HGF)抗體和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子抗體(connective tissue growth factor, CTGF)(購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。PBS磷酸緩沖鹽(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)；TMS-P超敏試劑盒(購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；DAB顯色劑(購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

U-3010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津；CX-7型全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)Beckman公司生產(chǎn)；YG-280KX型攤片機(jī)和YG-280KX型烤片機(jī)，湖北孝感市陽(yáng)光神琦醫(yī)用科技有限公司；BX43型光電顯微鏡，奧林巴斯中國(guó)有限公司；JKDP2型電熱恒溫培養(yǎng)箱，廈門醫(yī)療電子儀器廠。RM2235型切片機(jī)、TP1020型自動(dòng)脫水機(jī)，德國(guó)(徠卡)；JTS-3B型電子秤，廈門懿恒電子有限公司；HWS-100F型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海丙林電子科技有限公司；PHS-3G型pH計(jì)，武漢天壹力儀器設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1造模及給藥:購(gòu)入大鼠后適應(yīng)飼養(yǎng)1周，按體質(zhì)量大小獲得原始編號(hào)，再按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、復(fù)方山楂煎劑14.85 g生藥/kg低劑量組，29.7 g生藥/kg中劑量組，59.4 g生藥/kg高劑量組，脂必妥1.5 g/kg陽(yáng)性藥物對(duì)照組。每組10只，雌雄各半?？瞻讓?duì)照組喂飼普通飼料，其余各組喂飼高脂飼料[4-5](膽固醇5%、豬油15%、丙基硫氧嘧啶0.2%、膽酸鈉0.2%)8周后，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃蒸餾水，各給藥組灌胃相應(yīng)藥物，1次/d，容積為10 mL/kg，治療給藥6周。治療給藥6周后各組大鼠禁食不禁水14 h后稱重，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg),腹主動(dòng)脈取血后，取肝臟稱重并計(jì)算肝體比(肝體比=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)，血液于室溫靜置1 h后離心分離血清，按試劑盒說(shuō)明操作檢測(cè)血清MDA、SOD、ALT、AST的活性。每只大鼠取肝臟的相同部位0.1 g勻漿后提取上清液用于肝組織中TG的含量的測(cè)定。另取相同部位肝組織用福爾馬林固定，進(jìn)行HE染色，采用免疫組化法檢測(cè)肝組織中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的表達(dá)。

1.4.2肝組織HE染色:切片常規(guī)脫蠟，用蘇木精染色5 min，1%鹽酸乙醇分化，0.5%伊紅液染色5 min，梯度脫水，透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察肝細(xì)胞脂肪變性程度。

1.4.3免疫組化法檢測(cè)肝臟組織中HGF及CTGF的表達(dá):切片脫蠟至水后。采用3% H202室溫孵育15 min，用于消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。使用蒸餾水洗1次，再用PBS緩沖溶液浸洗3次，每次5 min。滴加10%的山羊血清，于室溫下孵育10 min后傾去血清。然后滴加一抗(HGF 稀釋比例為1∶300，CTGF 稀釋比例為1∶350)，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h。PBS緩沖溶液浸洗3次，每次5 min。滴加生物素標(biāo)記的二抗，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。PBS緩沖溶液浸洗3次，每次5 min。滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉素工作液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。PBS緩沖溶液浸洗3次，每次5 min。最后滴加DAB顯色劑顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明后采用中性樹膠封片。使用ImageJ軟件對(duì)免疫組化圖片進(jìn)行灰度值分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方山楂煎劑對(duì)血液生化指標(biāo)影響

經(jīng)喂飼高脂飼料造模后，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組血清MDA、ALT、AST顯著升高(P<0.01),與空白對(duì)照組相比模型對(duì)照組血清SOD顯著降低(P<0.01)。各給藥組經(jīng)6周治療后，與模型對(duì)照組相比各給藥組血清中MDA、ALT較模型對(duì)照組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，復(fù)方山楂煎劑中劑量組、高劑量組、脂必妥組血清中AST顯著降低(P<0.05或P<0.01)，復(fù)方山楂煎劑中劑量組、高劑量組血清中SOD顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 復(fù)方山楂煎劑對(duì)肝臟TG含量及肝體比的影響

經(jīng)8周喂飼高脂飼料后，模型對(duì)照組肝臟中TG顯著增多，肝體比顯著增加(P<0.01)，與模型對(duì)照組相比各給藥組經(jīng)6周治療后肝組織中TG含量及肝體比顯著降低(P<0.05或P<0.01)(表2)。

表1 復(fù)方山楂煎劑對(duì)血清中MDA含量以及SOD、ALT、AST活力的影響Table 1 Effect of Shanzha decoction on MDA content and SOD, ALT, AST activity in

表2 復(fù)方山楂煎劑對(duì)肝體比及肝臟中甘油三酯含量的影響Table 2 Effect of Shanzha decoction on liver weight coefficient and liver

2.3 復(fù)方山楂煎劑對(duì)在肝臟組織中脂肪病變的影響

與空白對(duì)照組相比模型對(duì)照組肝臟組織中脂肪泡明顯增大，與模型對(duì)照組相比復(fù)方山楂煎劑各組、脂必妥組肝臟組織中脂肪泡有所減小，見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色(×200)注：A：空白對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：復(fù)方山楂煎劑低劑量組；D：復(fù)方山楂煎劑中劑量組；E：復(fù)方山楂煎劑高劑量組；F：脂必妥組Fig. 1 HE staining (× 200)Note：A:Blank control group;B:Model control group;C: Shanzha decoction Low dose group；D:Shanzha decoctionmiddle dose group;E:Shanzha decoction high dose group;F:Zhibituo group

2.4 復(fù)方山楂煎劑對(duì)HGF及CTGF在肝臟組織中表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比模型對(duì)照組肝臟組織中HGF及CTGF表達(dá)顯著增加(P<0.01)，與模型對(duì)照組相比復(fù)方山楂煎劑中劑量組、劑量組、脂必妥組肝臟組織中HGF表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01)，與模型對(duì)照組相比復(fù)方山楂煎劑各劑量組、脂必妥組肝臟組織中CTGF表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)表3、圖2、圖3。

表3 各組肝臟組織中HGF及CTGF表達(dá)(灰度值)的比較Table 3 Comparison of HGF and CTGF expression in liver

圖2 大鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的結(jié)果(×200)注：A：空白對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：復(fù)方山楂煎劑低劑量組；D：復(fù)方山楂煎劑中劑量組；E：復(fù)方山楂煎劑高劑量組；F：脂必妥組Fig. 2 Results of rat HGF expression in liver tissue(× 200)Note：A:Blank control group;B:Model control group;C: Shanzha decoction Low dose group；D:Shanzha decoction middle dose group;E:Shanzha decoction high dose group;F:Zhibituo group

圖3 大鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的結(jié)果(×200)注：A：空白對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：復(fù)方山楂煎劑低劑量組；D：復(fù)方山楂煎劑中劑量組；E：復(fù)方山楂煎劑高劑量組；F：脂必妥組Fig. 3 Results of rat CTGF expression in liver tissue(×200)Note：A:Blank control group;B:Model control group;C: Shanzha decoction Low dose group；D:Shanzha decoctionmiddle dose group;E:Shanzha decoction high dose group;F:Zhibituo group

3 討論

復(fù)方山楂煎劑中所含山楂、延胡索、丹參、菊花、紅花、麥芽均可入肝經(jīng)，具有消食、祛瘀、活血、行氣、止痛的功效，用于胸脅脹滿、脘腹疼痛等與脂肪肝密切相關(guān)的病癥，復(fù)方山楂煎劑用量為每劑165 g，每日1劑，根據(jù)人與大鼠藥物劑量轉(zhuǎn)換系數(shù)得出大鼠給藥生物等效量為14.85 g生藥/kg，設(shè)14.85 g生藥/kg為本研究的低劑量，中劑量為低劑量2倍，高劑量為中劑量2倍。本項(xiàng)目研究了復(fù)方山楂煎劑對(duì)高脂飲食誘發(fā)大鼠脂肪肝形成的影響。HE染色結(jié)果顯示模型對(duì)照組肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的透明空泡是肝細(xì)胞脂肪變性引起的，經(jīng)HE染色后肝組織內(nèi)的脂肪被洗脫，所以HE染色后在肝組織內(nèi)留下透明的空泡，空泡越明顯，脂肪肝變性越嚴(yán)重[6]，而復(fù)方山楂煎劑各組較模型組肝組織脂肪變性明顯減輕，說(shuō)明采用活血行氣，化濁散瘀法治療脂肪肝效果顯著。

氧化應(yīng)激引起的改變可能在脂肪肝中起重要作用[7]。MDA等過(guò)氧化脂質(zhì)可使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生障礙，引起細(xì)胞功能失調(diào)甚至破裂[8]。由于ALT位于肝細(xì)胞漿中，AST在肝細(xì)胞線粒體，當(dāng)肝細(xì)胞膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體等內(nèi)膜系統(tǒng)有任何細(xì)微的改變都能影響其通透性，ALT、AST向肝血竇溢出，可導(dǎo)致血清ALT、AST活性增加[9]。ALT、AST活性的變化是肝細(xì)胞損傷的晴雨表，脂質(zhì)過(guò)氧化物可引起肝細(xì)胞炎性損傷[10]。非酒精性脂肪肝模型組大鼠MDA、ALT及AST活性比空白對(duì)照組顯著升高，表明脂質(zhì)過(guò)氧化，引起了肝細(xì)胞的損傷，復(fù)方山楂煎劑各治療組，血清MDA、ALT及AST活性顯著減低，表明復(fù)方山楂煎劑對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠模型確有抗氧化，減輕肝細(xì)胞損傷，降低ALT、AST活性的作用。

肥胖者由于脂肪量增加，激素敏感性脂肪酶活化，故合成TG增加，當(dāng)TG合成速度超過(guò)極低密度脂蛋白(VLDL)分泌速度時(shí)就會(huì)引起脂肪肝形成[11]。SOD 是一種金屬酶，主要存在于胞質(zhì)、溶酶體、過(guò)氧化體及線粒體內(nèi)，是機(jī)體抗氧化損傷防御體系中的最重要的抗氧化酶之一，不僅能特異的清除超氧化自由基，而且能催化超氧陰離子自由基使之歧化為過(guò)氧化氫，再通過(guò)過(guò)氧化氫酶的作用使之轉(zhuǎn)變成無(wú)毒性的水，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧代謝物的損傷[12]。文獻(xiàn)顯示灌胃給予120 mg/kg山楂黃酮可顯著降低高脂血癥大鼠血清丙二醛的含量，增強(qiáng)紅細(xì)胞和肝臟超氧化物歧化酶的活性，同時(shí)增強(qiáng)全血谷胱甘肽還原酶活性，從而提高抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物，預(yù)防脂代謝紊亂，山楂黃酮可以有效地保護(hù)給藥后大鼠肝臟細(xì)胞，使肝臟細(xì)胞損傷程度明顯降低[13]。本研究中復(fù)方山楂煎劑可顯著提高其血清SOD活力，同時(shí)可顯著降低脂肪肝大鼠肝臟TG含量，并使其肝體比顯著降低。

脂肪在肝臟中累積，然后引起慢性肝細(xì)胞損傷造成氧化應(yīng)激[14]，氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生凋亡或激活局部免疫反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[15]。因此肝臟轉(zhuǎn)化脂肪時(shí)是容易遭受損傷、壞死的過(guò)程[16]，肝臟細(xì)胞損傷必然引起肝臟的再生過(guò)程加速，雖然肝臟具有超強(qiáng)的再生能力，但是肝臟的強(qiáng)大修復(fù)能力也具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)，如果因?yàn)楦咧嬍硨?dǎo)致脂肪肝而使肝臟受到持續(xù)損傷，肝臟反復(fù)的修復(fù)也可以讓肝癌的發(fā)生的概率增加[17]。 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是一種可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生長(zhǎng)的多功能因子。在肝臟損傷后具有啟動(dòng)肝再生的功能，HGF刺激原代無(wú)血清培養(yǎng)的肝細(xì)胞DNA的合成，對(duì)多種組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的生理調(diào)節(jié)功能。HGF能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞再修復(fù)[18]。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)調(diào)節(jié)膠原纖維的合成和炎性反應(yīng)，在致癌作用等方面發(fā)揮重要作用[19]。肝纖維化是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)因具有明顯的趨化性，能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖。肝星狀細(xì)胞(HSC)是CTGF主要來(lái)源，而CTGF表達(dá)上調(diào)，也是HSC活化的中心環(huán)節(jié)。因此CTGF在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。本研究中復(fù)方山楂煎劑組可顯著降低HGF及CTGF在脂肪肝模型大鼠肝組織中的表達(dá)，因此可以降低脂肪肝向肝纖維化及肝癌發(fā)展的概率。

本研究結(jié)果表明復(fù)方山楂煎劑可降低血脂水平，減輕肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少了HGF及CTGF在脂肪肝模型大鼠肝組織的表達(dá)，復(fù)方山楂煎劑對(duì)非酒精性脂肪肝具有積極的治療作用。