藥物致橫紋肌溶解的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究*

裴 佩 鹿雙雙 汪聿坤 胡艷欣 盧選成 王 銳 路 凱

(1.中國疾病預(yù)防控制中心，北京 102206)(2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193)

橫紋肌溶解(Rhabdomyolysis，RM)是多種原因引起的橫紋肌細(xì)胞膜完整性破壞、肌肉組織溶解，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)、肌紅蛋白(Myoglobin，MYO)、酶類如肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)、醛縮酶、乳酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)等釋放入血，臨床可表現(xiàn)肌肉組織壞死，肢體疼痛、腫脹、功能障礙，往往伴有血尿，嚴(yán)重者可出現(xiàn)急性腎功能衰竭，甚至多臟器衰竭[1-3]。目前明確的導(dǎo)致RM的病因可分為獲得性因素及遺傳性因素兩大類，還有很大一部分病因不明確。哈夫病就是一種由于進(jìn)食加工后的淡水、海水產(chǎn)品后24 h內(nèi)突然發(fā)生的RM[4]，該病首次報(bào)道于1924年，至今病因不明，有關(guān)研究推測，病例進(jìn)食的水產(chǎn)品中可能存在一種耐高溫的未知致病因子，經(jīng)口攝入后導(dǎo)致了RM的發(fā)生[4]。為了篩選可能含有致病因子的食物樣本，為哈夫病病因研究提供線索，須進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。而目前研究RM的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多采用50%的甘油溶液肌肉注射導(dǎo)致RM的動(dòng)物模型[5]，是一種創(chuàng)傷性RM動(dòng)物模型，直接損傷肌細(xì)胞致病，不適用于哈夫病等非創(chuàng)傷性RM的研究。在非創(chuàng)傷性RM中，約50%的病例因服用藥物發(fā)病[6]，與哈夫病經(jīng)口攝入而致病的特點(diǎn)相似。我國2000—2018年藥源性RM的統(tǒng)計(jì)分析顯示，他汀類藥物引發(fā)RM的病例數(shù)量最高，占61.06%，與貝特類藥物聯(lián)合使用時(shí)RM發(fā)生率會升高[7]。因此，本研究通過對Wistar大鼠、ICR小鼠給予辛伐他汀(Simvastatin，SMV)、吉非羅齊(Gemfibrozil,GF)兩種藥物，觀察聯(lián)合給藥及單獨(dú)給藥引起肌肉損傷等生化指標(biāo)水平的變化情況，篩選出可發(fā)生橫紋肌溶解的動(dòng)物，為后續(xù)進(jìn)行哈夫病等病因不明的RM提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級Wistar大鼠5周齡雌性21只、雄性45只，SPF級ICR小鼠5周齡雌性21只，雄性45只，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0002，大鼠2只/籠，小鼠5只/籠，飼養(yǎng)在22～26 ℃，日溫差≤3 ℃，相對濕度40%～70%，換氣次數(shù)15次/h，照明時(shí)間12 h的負(fù)壓屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中，許可證編號：SYXK(京)2017-0021。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中國疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：2019-CCDC-IACUC-004, 2019-CCDC-IACUC-016)，每次實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物在設(shè)施內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)期間給予60Co照射滅菌鼠全價(jià)顆粒(維持料)飼料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水，實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

吉非羅齊膠囊(廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號：H44021201)；辛伐他汀膠囊(湖北舒邦藥業(yè)有限公司，批號：H20000107)；羧甲基纖維素鈉(上海嘉禾生物科技有限公司)；大鼠、小鼠肌紅蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：ML720372)；肌酸激酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，批號：141518012)。邁瑞B(yǎng)S-240VET全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；PHOMO酶標(biāo)儀(安圖生物公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1藥物的配置及劑量設(shè)置:SMV臨床成人每日最大攝入量為40 mg/d，GF臨床成人用量為600 mg/d，根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間與人體間劑量換算方法[8]及種間差異，得到20 g(標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量)小鼠SMV等效劑量為80 mg/kg，GF等效劑量為1200 mg/kg，150 g(標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量)大鼠SMV等效劑量為40 mg/kg，GF等效劑量為600 mg/kg。SMV及GF用0.5%CMC制成混懸液。

1.3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法:

1.3.2.1不同性別動(dòng)物進(jìn)行不同劑量SMV、GF聯(lián)合給藥實(shí)驗(yàn)

將大鼠、小鼠各42只，雌雄各半，按種屬、性別分開，隨機(jī)分為4組：低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組，其中高劑量組12只，其余各組10只，劑量如表1。采用灌胃給藥的方式，每天給藥1次，持續(xù)給藥14 d。大鼠、小鼠均于7 d、14 d給藥后24 h采集血液。

表1 不同劑量SMV、GF聯(lián)合給藥實(shí)驗(yàn)分組劑量Table 1 Dosage regime of different dose SMV and GF-administered animals

1.3.2.2SMV、GF聯(lián)合給藥、單獨(dú)給藥實(shí)驗(yàn):將雄性大鼠、小鼠各24只按種屬分開后，隨機(jī)分成4組，SMV&GF組、SMV組、GF組、對照組，分組及給藥劑量見表2。每天灌胃給藥1次，持續(xù)給藥14 d。小鼠于給藥前、給藥7 d、14 d后24 h采集血液，大鼠于給藥前、給藥3 d、6d、8 d、10 d、12 d、14 d后24 h采集血液。

1.3.3血液樣本采集:在麻醉機(jī)中加入異氟烷，旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)氧氣流量計(jì)前端的氣源閥門，使輸出的氣體達(dá)到所需要的流量(大鼠500～700 mL/min，小鼠300～500 mL/min)，打開麻醉機(jī)蒸發(fā)器，調(diào)節(jié)誘導(dǎo)濃度為4%，待異氟烷充滿誘導(dǎo)盒后，將動(dòng)物放入，等待2～3 min，待動(dòng)物完全麻醉，從誘導(dǎo)盒取出，左手固定鼠，壓迫頸部使其眼球充分外凸，右手持毛細(xì)玻璃管自內(nèi)眥插入眼瞼與眼球之間，略加捻轉(zhuǎn)，使血液自毛細(xì)管流入ep管中。大鼠采血量為1 mL，小鼠為0.5 mL。將血液于4 ℃冰箱放置過夜，4 ℃ 5 000 r/min離心15 min，分離血清，-20 ℃凍存。

1.3.4血清生化檢測：使用邁瑞B(yǎng)S-240VET全自動(dòng)生化分析儀測定收集到的血清中CK、ALT、AST含量。使用鼠源MYO酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒，體外定量檢測鼠血清中MYO表達(dá)水平(雙抗體夾心法)。具體的操作方法嚴(yán)格遵循試劑盒說明書進(jìn)行操作。

表2 SMV、GF聯(lián)合給藥、單獨(dú)給藥實(shí)驗(yàn)分組劑量Table 2 Dosage regime of SMV- and/or GF- administered animals

1.3.5組織學(xué)檢查：在最后一次采血后對動(dòng)物實(shí)施二氧化碳安樂死，取左后肢的股骨直肌、股二頭肌和腓腸肌三個(gè)部位骨骼肌，置于10%甲醛固定液中固定。骨骼肌標(biāo)本在10%甲醛固定液中固定至少24 h，選取CK值高于參考值上限5倍及發(fā)生步態(tài)不穩(wěn)、后肢無力或癱瘓等行為學(xué)改變的動(dòng)物肌肉標(biāo)本，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色查看橫紋肌溶解情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠RM發(fā)生情況

2.1.1不同性別、不同劑量組大鼠聯(lián)合給藥血清CK、ALT、AST的表達(dá)水平

給藥14 d后，低劑量組大鼠的血清CK、ALT、AST與對照組相比顯著升高(P<0.05)(表3)，雌性大鼠、雄性大鼠之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中低劑量組雄性大鼠有2只CK明顯升高，1只出現(xiàn)行為學(xué)改變(CK值3035.96 U/L)，另一只CK值高于參考值上限5倍(CK值4734.72 U/L)。根據(jù)這項(xiàng)結(jié)果，在后續(xù)不同藥物實(shí)驗(yàn)中采用SMV 20 mg/kg&GF 600 mg/kg這一劑量給藥?？紤]到性別無顯著性差異，為了避免雌性發(fā)情周期對生化指標(biāo)測定的影響，選擇雄性大鼠。

表3 不同性別、不同劑量組大鼠血清CK、ALT、AST的表達(dá)水平Table 3 serum CK, ALT,AST levels in different SMV dose administered male or female Wistar rats

2.1.2不同藥物組大鼠血清CK、MYO、ALT、AST的表達(dá)水平及變化趨勢

所有大鼠的CK值均未達(dá)到參考值上限5倍，也未觀察到明顯的后肢無力等行為學(xué)改變。各組的血清CK、MYO、ALT、AST水平及變化趨勢見圖1、表4。

與給藥前相比，SMV&GF組大鼠血清CK水平在給藥10 d后顯著升高(P<0.05)，達(dá)到峰值(1171.20±250.79 U/L)，而后一直保持在較高水平，CK水平在給藥6 d、10 d、12 d較同時(shí)間點(diǎn)對照組升高，差異顯著(P<0.05)。血清MYO水平在給藥后稍有上升，給藥第14天達(dá)峰值，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，給藥6 d、8d與同時(shí)間點(diǎn)對照組相比降低(P<0.05)。ALT與AST給藥10 d后開始顯著升高，給藥6 d、10 d、12 d、14 d時(shí)均高于對照組(P<0.05)。

圖1 不同藥物組大鼠血清CK、MYO、ALT、AST水平變化趨勢Fig.1 Time-dependent changes of serum CK, MYO,ALT, and AST levels in

表4 不同藥物組間大鼠血清CK、MYO、ALT、AST的表達(dá)水平Table 4 Effects of SMV and GF administration serum CK, MYO, ALT, and AST levels in rats

SMV組大鼠血清CK水平波動(dòng)較大，在給藥3 d后達(dá)到峰值(1789.62±508.03 U/L)，與給藥前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但在給藥6 d后降至最低(464.57±202.36 U/L)，之后又緩慢上升，第10天達(dá)第二高峰，CK水平在給藥3 d及8d、10 d、12 d較相同時(shí)間點(diǎn)對照組升高(P<0.05)。血清MYO水平在給藥前后的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對照組相比，給藥6 d，8 d，12 d時(shí)低于對照組(P<0.05)。血清ALT給藥3 d時(shí)出現(xiàn)一過性升高(P<0.05)，且高于對照組(P<0.05)。血清AST水平同樣在給藥3 d時(shí)一過性升高(P<0.05)，隨后降低，與對照組相比，給藥3 d、8 d、10 d時(shí)AST顯著升高(P<0.05)。

GF組大鼠血清CK給藥3 d后一過性升高(P<0.05)，給藥6 d后與對照組相比有所上升(P<0.05)。血清MYO給藥前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，給藥3 d、6 d、8 d、12 d時(shí)低于對照組(P<0.05)。血清ALT、AST給藥3 d時(shí)高于給藥前，且高于對照組(P<0.05)。

2.1.3大鼠骨骼肌肉組織病理學(xué)變化

對1只對照組大鼠、1只血清CK水平超過參考值上限5倍(CK值4734.72 U/L)的SMV&GF組大鼠、1只出現(xiàn)后肢無力表現(xiàn)(CK值3035.96 U/L)的SMV&GF組大鼠所采集骨骼肌標(biāo)本進(jìn)行HE染色病理檢查。對照組大鼠(圖2-A-2)骨骼肌細(xì)胞呈長形，可看到交錯(cuò)的橫紋；出現(xiàn)行為學(xué)改變的大鼠(圖2-C-1，圖2-C-2)肌纖維嚴(yán)重壞死、消失，肌纖維間可見大量的淋巴細(xì)胞、多核巨細(xì)胞、巨細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤；CK值超過參考值上限5倍的大鼠(圖2-B-1，圖2-B-2)病理檢查未見明顯異常。

圖2 大鼠骨骼肌病理變化(HE染色)Fig.2 Histological examination of the skeletal muscle in rats(HE staining)

2.2 小鼠RM發(fā)生情況

2.2.1不同性別、不同劑量組聯(lián)合給藥小鼠血清CK、ALT、AST的表達(dá)水平

給藥14 d后，中劑量組雄性小鼠的血清CK水平與對照組相比有所升高(P<0.05)，不同性別的小鼠間CK、ALT水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，雄性小鼠高于雌性小鼠。根據(jù)這項(xiàng)結(jié)果，在不同藥物給藥實(shí)驗(yàn)中均采用SMV80 mg/kg&GF1 200 mg/kg這一劑量對雄性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中，3只小鼠CK值超過參考值上限的5倍，均為低劑量組雄性小鼠；所有小鼠均未觀察到明顯行為學(xué)改變。

表5 不同性別、不同劑量組小鼠血清CK、ALT、AST的表達(dá)水平Table 5 Serum CK、ALT、AST levels in different SMV dose administeredmale or female ICR mice

2.2.2不同藥物組小鼠血清CK、MYO、ALT、AST的表達(dá)水平及變化趨勢

由圖3可知，SMV&GF組小鼠血清CK水平在給藥后持續(xù)升高，給藥14 d達(dá)到峰值，血清MYO水平在給藥14 d較給藥前稍有上升，血清ALT、AST給藥第7天后稍有降低，并于給藥14 d上升，但與給藥前相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SMV組與GF組小鼠的血清CK、MYO、ALT、AST給藥前后差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同給藥組小鼠與對照組相比血清CK、ALT、AST水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SMV&GF組、SMV組小鼠給藥14 d時(shí)血清MYO水平較對照組升高(P<0.001)，其他血清指標(biāo)結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)。血清CK值高于參考值上限5倍的小鼠有2只，均為SMV&GF組小鼠(2430.17 U/L,3245.16 U/L)，但同組的其余4只小鼠CK值均未升高。所有小鼠均未觀察到行為學(xué)改變，見表6。

表6 不同藥物組小鼠各時(shí)間點(diǎn)血清CK、MYO、ALT、AST的表達(dá)水平Table 6 SMV and GF administrationon serum CK, MYO, ALT, and AST levels in mice

圖3 不同給藥組小鼠血清CK、MYO、ALT、AST水平變化趨勢Fig.3 Time-dependent changes of serum CK, MYO,ALT and AST levels in

3 討論

藥物因素在RM獲得性非創(chuàng)傷性病因中占很大一部分[9-10]，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，篩選出能發(fā)生藥物相關(guān)RM的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對研究非創(chuàng)傷性RM如哈夫病具有參考價(jià)值。本研究選擇SMV、GF兩種藥物探索在不同性別的ICR小鼠、Wistar大鼠中造成RM的情況，發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠在SMV、GF聯(lián)合給藥時(shí)肌酸激酶升高，發(fā)生肌肉損傷，為后續(xù)進(jìn)行哈夫病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了參考，也為建立藥物相關(guān)RM動(dòng)物模型奠定了基礎(chǔ)。

目前臨床中導(dǎo)致RM的藥物主要是用作降脂的他汀類藥物，即HMG-CoA還原酶抑制劑，包括SMV、普伐他汀、洛伐他丁、阿托伐他汀等，常與貝特類抗高三酰甘油藥物聯(lián)合用于治療混合型高脂血癥和單一用藥不能控制的高脂血癥[11]。其中，西立伐他汀與貝特類代表藥物GF聯(lián)用曾導(dǎo)致了大量病例死亡，迫使西立伐他汀全球撤市[12]。他汀類藥物的肌肉毒性風(fēng)險(xiǎn)由高至低排序依次為西立伐他汀、SMV、洛伐他汀、普伐他汀[13]。因此，本研究采用SMV、GF兩種藥物聯(lián)合給藥進(jìn)行探究。

肌細(xì)胞損傷是RM的主要表現(xiàn)，血清中CK、MYO、ALT、AST的含量反映肌細(xì)胞內(nèi)容物入血情況[14-16]。臨床上RM的診斷標(biāo)準(zhǔn)為肌肉疼痛伴有血清CK值上升到參考值上限5倍以上[11]。血清中ALT、AST水平常常升高，MYO會超過血清球蛋白的結(jié)合能力，被轉(zhuǎn)運(yùn)至腎小球最終隨著尿液排出。本研究通過檢測CK、MYO、ALT、AST的水平來衡量RM的發(fā)生情況。結(jié)果表明，20 mg/kgSMV和600 mg/kgGF 聯(lián)合給藥，Wistar大鼠灌胃10 d后，可以引起大鼠血清CK、ALT、AST水平明顯升高，與給藥前及同時(shí)間點(diǎn)對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CK水平超過50日齡Wistar大鼠CK值參考值[17]，但未達(dá)到臨床RM診斷標(biāo)準(zhǔn)。造成這一結(jié)果的原因可能是嚙齒類動(dòng)物與人類之間對藥物的敏感性不同，且動(dòng)物的個(gè)體差異較大，臨床上CK的參考值為18.0～198.0 U/L，而Wistar大鼠CK參考值為443.22～942.28 U/L，C57/BL6小鼠CK 97.5%置信區(qū)間值為377 U/L，嚙齒類動(dòng)物的CK值比人類高且波動(dòng)范圍更大。RM臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)可能并不能完全適用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在實(shí)驗(yàn)中陰性對照組及基線CK水平的參考十分重要。在給藥6 d后血清CK、ALT、AST與對照組相比有所升高，但在第8天有所下降，可能自給藥第6天起就發(fā)生了肌肉損傷，但由于機(jī)體自適應(yīng)及血清肌酶的半衰期，被機(jī)體代償清除[18]。單一給予SMV組的大鼠給藥3 d后血清CK、ALT、AST出現(xiàn)了一過性升高，在給藥前血清CK(969.34±602.29 U/L)高于參考值上限，對給藥后的CK造成了一定影響。單一給予GF的大鼠給藥3 d后血清CK、ALT、AST出現(xiàn)了一過性升高，也未能引起大鼠出現(xiàn)穩(wěn)定的肌肉損傷改變，這與既往GF對SD大鼠未造成明顯肌肉毒性的研究結(jié)果是一致的[19-20]。與大鼠相比，小鼠在SMV、GF聯(lián)合給藥后，CK值并未普遍升高，單獨(dú)給藥也未引起CK升高，小鼠對肌肉毒性藥物不敏感。本研究CK水平并未發(fā)現(xiàn)有劑量效應(yīng)相關(guān)性，與流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)西立伐他汀臨床用藥肌肉毒性與劑量有相關(guān)性[21]這一結(jié)論不一致。

本研究中各組MYO值與給藥前相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對照組同期相比，甚至有降低的情況，可能是由于血清MYO值受以下因素的影響：一是血清MYO清除速率快于CK，通常在CK值升高前就有所升高并在CK值下降前降至正常[22]。二是本研究中MYO值的測定采用酶聯(lián)免疫分析法，溶血可能會造成結(jié)果誤差。因此，檢測血清MYO對RM的診斷敏感性不高。

肌肉活檢是確診RM的金標(biāo)準(zhǔn)，但在臨床中并非必須的檢查[23]。本研究中對2只SMV&GF組大鼠骨骼肌進(jìn)行病理檢查，RM表現(xiàn)檢出率為50%，且CK值高的大鼠并未發(fā)現(xiàn)病理改變，說明CK水平與病理損傷程度并非呈正比關(guān)系。但值得注意的是，出現(xiàn)行為學(xué)改變的大鼠在給藥第4天時(shí)觀察到胸口處有鼓包現(xiàn)象，判斷可能是灌胃造成食管損傷所致，后鼓包有所吸收，與同組其他大鼠相比，這只大鼠明顯精神差、毛發(fā)亂、活動(dòng)度降低。灌胃損傷可能加劇了藥物導(dǎo)致的RM癥狀，具體原因還需要進(jìn)一步的研究。

因?yàn)楸狙芯课磳λ袆?dòng)物進(jìn)行統(tǒng)一評分的肌肉病理檢查，不能明確RM的組織學(xué)確診情況，因此不能評判SMV、GF聯(lián)合給藥在Wistar大鼠中是否成功建立了具有可重復(fù)性的藥物相關(guān)RM動(dòng)物模型。但本研究結(jié)果顯示W(wǎng)istar大鼠是建立模型的良好選擇，對藥物表現(xiàn)較為敏感。

綜上所述，本研究通過對兩種性別的Wistar大鼠、ICR小鼠進(jìn)行藥物因素相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，大鼠在SMV、GF的聯(lián)合作用下，出現(xiàn)了肌酸激酶升高的RM癥狀，在進(jìn)行哈夫病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，可考慮使用Wistar大鼠。ICR小鼠對SMV和GF的聯(lián)合及單獨(dú)給藥作用表現(xiàn)不敏感。