獼猴進(jìn)行遙測系統(tǒng)植入子植入手術(shù)的經(jīng)驗體會*

盧祺炯 徐 聰 陳靈芳 楊 倩 夏麗娟 楊紅忠 鄭高利

(杭州醫(yī)學(xué)院安全性評價研究中心，杭州 310053)

安全藥理學(xué)研究中，為獲取更加準(zhǔn)確的藥物的非期望影響的暴露劑量、暴露時間等信息，使用遙測系統(tǒng)，通過長時間不間斷獲取清醒無束縛動物給藥前后的呼吸、心電、血壓等核心指標(biāo)數(shù)據(jù)，經(jīng)綜合分析與比較，以確認(rèn)藥物可能的對動物心血管系統(tǒng)與呼吸系統(tǒng)的不良影響，該方法符合中國食品藥品監(jiān)督管理總局《藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[1]、ICH S7A《Safety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals》[2]對安全藥理學(xué)研究試驗方法的要求。遙測系統(tǒng)的硬件主要分兩類：一類是依靠植入子監(jiān)測動物心血管、呼吸系統(tǒng)的數(shù)據(jù)，該類設(shè)備需要對動物進(jìn)行植入子植入手術(shù)，手術(shù)恢復(fù)后方可開展試驗；另一類是應(yīng)用無創(chuàng)遙測技術(shù)，將傳感器置于動物體表，并用馬甲保護(hù)和放置遙測系統(tǒng)設(shè)備，此類設(shè)備無需進(jìn)行手術(shù)，只需要對動物進(jìn)行馬甲穿著的訓(xùn)練篩選依從性好的動物即可開展試驗。在選擇試驗儀器時，應(yīng)根據(jù)供試品特征與試驗要求選擇植入或者無創(chuàng)的方法。

梁春南[3]曾報道犬因傷口開裂后續(xù)感染導(dǎo)致植入手術(shù)失敗，為了避免本試驗猴術(shù)后出現(xiàn)類似的情況，作者根據(jù)之前應(yīng)用Beagle犬進(jìn)行植入手術(shù)出現(xiàn)過的一些異常狀況，根據(jù)猴的身體特征，針對性地調(diào)整了手術(shù)方案、并對可能出現(xiàn)不期望出現(xiàn)的不良反應(yīng)建立了解決預(yù)案，最終全部8只受術(shù)猴手術(shù)順利完成、術(shù)后愈合良好，血液學(xué)、生化學(xué)指標(biāo)與心血管系統(tǒng)未顯示感染或炎癥指標(biāo)，植入子工作正常，并順利地完成了后期的安全藥理學(xué)試驗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

恒河猴，普通級，年齡3～5歲，體質(zhì)量3.1～6.5 kg，8只，雌雄各半，由寧波市鄞州東吳天童獼猴養(yǎng)殖場提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(浙)2013-0027，動物質(zhì)量合格證號：0002570。飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評價研究中心普通級猴飼養(yǎng)室中，溫度16～26 ℃，相對濕度40%～70%，中央空調(diào)集中通風(fēng)8～10次/h，光照12 h明、12 h暗，實驗動物使用許可證：SYXK(浙)2012-0176。喂飼猴全價顆粒營養(yǎng)飼料，LAWS-2000實驗動物反滲透純水機(jī)處理的飲水。經(jīng)IACUC批準(zhǔn)動物使用申請書編號GLP-A-033。

1.2 主要儀器與試劑

DSI電生理遙測系統(tǒng)，植入子型號TL11M3-D70-PCTR，美國DSI公司;Matrix動物麻醉機(jī)，美國MIDMARK公司;BayerADVIA 2120血細(xì)胞分析儀，西門子公司;日立7100全自動生化儀，日本日立公司;TCS-15電子秤，梅特勒-托利多;注射用頭孢西丁鈉(0.5 g/瓶)，批號：120615，?？谑兄扑帍S有限公司。

雙氯芬酸鈉緩釋膠囊(50 mg)，批號：130105，南京長澳制藥有限公司;戊巴比妥鈉，批號：WS20171005，規(guī)格：25 g/瓶，購于上海西唐生物科技有限公司;異氟烷，批號：120204，魯南貝特制藥有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1術(shù)前準(zhǔn)備工作：猴檢疫結(jié)束次日，稱體質(zhì)量，后肢靜脈抽血樣進(jìn)行5分類血常規(guī)分析與生化學(xué)分析，如出現(xiàn)WBC分類異常伴隨體溫偏高的、PLT偏低、PT較長的猴，則請獸醫(yī)對癥處理，恢復(fù)正常后再行安排手術(shù)。術(shù)前3 d耳溫計檢測體溫；之后肌注注射用頭孢西丁鈉0.5 g/猴，對動物進(jìn)行圍手術(shù)期抗生素覆蓋處理，連續(xù)2 d；術(shù)前禁食不禁水12 h以上。預(yù)備經(jīng)清洗、消毒、干燥的猴飼養(yǎng)籠作術(shù)后恢復(fù)關(guān)養(yǎng)用。

1.3.2麻醉方法與麻醉程度的控制：術(shù)前后肢靜脈緩慢注射3%戊巴比妥鈉1 mL/kg體質(zhì)量誘導(dǎo)麻醉，以四肢松弛并且牽拉無反抗、針刺反射消失、眼瞼反射遲鈍為誘導(dǎo)麻醉完成狀態(tài)，之后完成備皮、建立靜脈通道、滴注0.5%頭孢西丁鈉注射液(100 mL)等預(yù)備工作后手術(shù)臺固定，異氟烷吸入維持麻醉。麻醉維持期間不間斷觀察猴麻醉狀態(tài)，如猴出現(xiàn)肌張力增加、身體扭動等異常狀況時，應(yīng)暫停手術(shù)操作并增加異氟烷蒸發(fā)速度加深麻醉程度，若心率減慢過快同時血壓降低(遙測系統(tǒng)手術(shù)時可監(jiān)測猴血壓和心率)則減少異氟烷的蒸發(fā)速度。

1.3.3手術(shù)方法：確認(rèn)猴的麻醉狀態(tài)適宜手術(shù)之后，即按本機(jī)構(gòu)制定的植入子手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程完成植入手術(shù)。分別在猴的右側(cè)鎖骨下方(與身體縱軸垂直，切開約2 cm)、左右兩側(cè)腋下第五對肋骨處(平行身體縱軸，切開約5 cm)、左下腹腹斜肌位置(平行身體縱軸，切開約8 cm)、左后肢股動脈位置(與股骨平行，切開約3 cm)先后作切口。左側(cè)腹部腹斜肌鈍性分離開口，在肌層下方鈍性分離出一個可以放置植入子本體的“口袋”，置入植入子后，先后將壓力導(dǎo)管插入左后肢股動脈、心電和呼吸電極導(dǎo)線自皮下建立的通道導(dǎo)引至左右兩側(cè)腋下和右側(cè)鎖骨下方并固定，完成以上植入操作，肌肉層與皮下組織用4號吸收縫合線分層間斷縫合，皮膚3號吸收縫合線皮內(nèi)連續(xù)縫合，全部切口縫合完畢，經(jīng)鼻飼灌胃雙氯芬酸鈉膠囊內(nèi)容物用以術(shù)后鎮(zhèn)痛，待0.5%頭孢西丁鈉注射液滴注結(jié)束后停止異氟烷吸入。移回猴飼養(yǎng)籠內(nèi)側(cè)臥放置待蘇醒，期間打開植入子電源開關(guān)并監(jiān)測猴心電、血壓等參數(shù)，觀察至術(shù)后4 h確認(rèn)無嘔吐、縫合處無開裂與大量滲血，心電、血壓等指標(biāo)無異常后方可關(guān)閉植入子電源并離開。

1.3.4術(shù)后觀察與護(hù)理：術(shù)后次日起，每日觀察并記錄受術(shù)猴切口的狀態(tài)，出現(xiàn)疑似感染時及時抽取血樣檢查血液學(xué)與生化學(xué)指標(biāo)，并給予對癥治療?；謴?fù)期間鼻飼法灌胃雙氯芬酸鈉膠囊內(nèi)容物每日1粒，給藥2 d；肌注注射用頭孢西丁鈉0.5 g/d，給藥3 d；每日碘伏擦拭消毒切口至愈合；每日觀察縫合處有無開裂、血腫等異常，如有血腫但縫合處無特殊狀態(tài)，可用注射器穿刺至積液處抽取。至術(shù)后7 d起，傷口結(jié)痂愈合、無水腫的，稱量體質(zhì)量，抽取血樣進(jìn)行血液生化檢測，測量耳溫，并開啟遙測系統(tǒng)記錄猴的心電、呼吸、血壓等指標(biāo)1 h，經(jīng)分析比較后如各指標(biāo)正常即認(rèn)為可進(jìn)行下一步的安全藥理學(xué)試驗。

1.3.5各類檢測指標(biāo)選擇與比較方法： 血常規(guī)選取WBC(白細(xì)胞)、RBC(紅細(xì)胞)、HGB(血紅蛋白)、PLT(血小板)、NEUT(中性粒細(xì)胞)、LYMPH(淋巴細(xì)胞)、MONO(單核粒細(xì)胞)、EOS(嗜酸性粒細(xì)胞)、BASO(嗜堿性粒細(xì)胞)、 NEUT(中性粒細(xì)胞計數(shù))、LYMPH(淋巴細(xì)胞計數(shù))、MONO(單核粒細(xì)胞計數(shù))、EOS(嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù))、BASO(嗜堿性粒細(xì)胞計數(shù))進(jìn)行手術(shù)前后比較；生化學(xué)選取ALT(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)、AST(天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)、TP(總蛋白)、ALB(白蛋白)、TBIL(總膽紅素)、ALP(堿性磷酸酶)、GLU(血糖)、BUN(尿素氮)、Crea(肌酐)進(jìn)行手術(shù)前后比較；心電、呼吸和血壓選取HR(心率)、R-H(R波幅度)、P-H(P波幅度)、T-H(T波幅度)、ST-E(ST位移)、QRS(QRS時程)、PR-I(PR間期)、QT-I(QT間期)、QTcb(校正QT間期)、SYS(收縮壓)、DIA(舒張壓)、Mean(平均壓)、呼吸頻率等指標(biāo)與獼猴白晝基礎(chǔ)值進(jìn)行比較；體溫進(jìn)行手術(shù)前后比較。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)結(jié)果

2.1.1術(shù)前肌注給予注射用頭孢西丁鈉，對動物實行抗生素覆蓋；應(yīng)用3%戊巴比妥鈉1 mL/kg劑量靜脈注射誘導(dǎo)麻醉；術(shù)前備皮；異氟烷吸入維持麻醉等試驗操作均順利完成，期間無異常。

2.1.2猴術(shù)中出血量少、皮下脂肪少、止血快、術(shù)野清晰；皮膚與皮下組織易分離、縫合難度較大，縫合操作量多；吸入維持麻醉的程度易控制，術(shù)中猴均未見任何異常。一般在術(shù)后30 min內(nèi)恢復(fù)意識開始清醒，開始出現(xiàn)睜眼、轉(zhuǎn)頭、四肢伸縮等活動，但保持側(cè)臥狀態(tài)；至術(shù)后3～5 h猴可坐或趴臥，活動少；至術(shù)后24 h觀察均恢復(fù)基本的活動能力，正常攝食飲水。

2.1.3術(shù)后護(hù)理期間，猴神態(tài)、活動、飲食、應(yīng)激反應(yīng)均正常，各切口術(shù)后愈合良好，至術(shù)后7 d均可結(jié)束護(hù)理，轉(zhuǎn)至實驗使用，全部猴未見可能因術(shù)后恢復(fù)不良導(dǎo)致的受術(shù)區(qū)域的功能異常。術(shù)中建立的皮下導(dǎo)管和電極導(dǎo)線通道區(qū)域，全部8只猴術(shù)后1～2 d均發(fā)現(xiàn)至左后肢的壓力導(dǎo)管通道位置均出現(xiàn)短期、程度不一的輕度水腫，但無需干預(yù)處理，術(shù)后3～5 d水腫全部消失。手術(shù)前后猴的平均體質(zhì)量分別為(4.88±0.76)與(4.86±0.70)kg，n=8，配對t檢驗結(jié)果t=0.424(P>0.05)；手術(shù)耗時(134～260)min，平均(182.0±43.7)min；蘇醒耗時(12～24)min，平均(17.5±4.1)min；術(shù)后活動起始時間為3～5 h，平均(3.6±0.7)h；后肢在術(shù)后1～2 d內(nèi)均出現(xiàn)水腫，平均(1.4±0.5)d；后肢水腫在術(shù)后3～4 d均消退，平均(3.8±0.5)d。

2.2 各類指標(biāo)手術(shù)前后檢測結(jié)果

2.2.1血常規(guī):對各項5分類血常規(guī)指標(biāo)手術(shù)前后配對比較t檢驗發(fā)現(xiàn)：除RBC、HGB、LYMPH三項血液學(xué)指標(biāo)術(shù)后檢測結(jié)果低于手術(shù)前之外(P<0.05或P<0.01)，其余指標(biāo)手術(shù)前后相似(P>0.05)，未見明顯變化。詳見表1。

表1 獼猴手術(shù)前后血常規(guī)指標(biāo)Table 1 Rhesus monkey’s blood routine indicators before and after surgery

2.2.2生化學(xué)：對各項生化學(xué)指標(biāo)手術(shù)前后配對比較t檢驗發(fā)現(xiàn)：ALT、TP的術(shù)后均值低于手術(shù)前(P<0.05或P<0.01)，AST的術(shù)后均值高于手術(shù)前(P<0.05)，其余指標(biāo)手術(shù)前后均相似(P>0.05)，未見明顯變化。詳見表2。

表2 獼猴手術(shù)前后生化學(xué)指標(biāo)Table 2 Rhesus monkey's biochemical indicators before and after surgery

2.2.3心電、血壓、呼吸、體溫：受術(shù)猴術(shù)后第7日應(yīng)用遙測系統(tǒng)檢測心電、血壓、呼吸等指標(biāo)，與作者之前獲得的獼猴白晝基礎(chǔ)值[4]進(jìn)行單樣本t檢驗比較發(fā)現(xiàn)，T波幅度與呼吸頻率有少許降低，其余指標(biāo)手術(shù)前后相似，未見明顯變化。詳見表3。

獼猴體溫手術(shù)前后測量值分別為(37.3±0.4)℃和(36.9±0.5)℃，配對t檢驗結(jié)果n=8，t=1.943，P=0.093，手術(shù)前后無顯著性差異。

表3 獼猴手術(shù)后心電、血壓、呼吸指標(biāo)Table 3 Post-operative ECG, blood pressure, and respiratory index of Rhesus monkey

3 討論

3.1 結(jié)論

通過獼猴遙測系統(tǒng)植入子植入手術(shù)實例，成功實施猴應(yīng)用遙測系統(tǒng)的手術(shù)流程，術(shù)后愈合良好，提高了遙測動物模型建模的成功率。對國內(nèi)機(jī)構(gòu)使用植入式遙測系統(tǒng)建立大動物模型在安全藥理學(xué)研究的應(yīng)用中起到一定的借鑒作用。

3.2 討論

3.2.1猴血液學(xué)與生化學(xué)指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)術(shù)后RBC、HGB、ALT、TP的均值低于手術(shù)前，AST值高于手術(shù)前等變化。上述變化中RBC與HGB降低可能與手術(shù)期間失血與術(shù)后出血有關(guān)，ALT的降低變化無臨床意義，但TP降低、AST升高可能與術(shù)后愈合過程中創(chuàng)口自修復(fù)過程有相關(guān)性。呼吸、血壓、心電指標(biāo)與猴白晝基礎(chǔ)值比較，僅有術(shù)后T波幅度、呼吸頻率偏低，考慮大部分心血管系統(tǒng)指標(biāo)均符合猴的白晝基礎(chǔ)值，且各類指標(biāo)基本偏向于頻率減緩(HR)、幅度降低(RH、PH、TH等)、時間延長(QRS、QT、QTc等)的基礎(chǔ)值下降的變化趨勢，故作者認(rèn)為T波幅度與呼吸頻率降低的變化與術(shù)后恢復(fù)期間生理指標(biāo)基礎(chǔ)值降低趨勢是一致的，并無參考意義。綜合血液學(xué)、生化學(xué)、心血管系統(tǒng)的指標(biāo)手術(shù)前后的變化，可以認(rèn)為猴手術(shù)期間無感染、炎癥等不良反應(yīng)。

3.2.2考慮到猴在試驗中的依從性、體質(zhì)量、年齡和猴的基礎(chǔ)衛(wèi)生狀況等因素，圍手術(shù)期抗生素覆蓋的給藥劑量參照幼兒給藥量給予，給藥方式術(shù)前與術(shù)后使用肌注，術(shù)中應(yīng)用靜脈滴注給予。

3.2.3Bertrand等曾報道過異氟烷與七氟烷的麻醉效果相同[5]，劉雪萍等也認(rèn)為異氟烷是效果優(yōu)秀的全身麻醉藥品[6]，且異氟烷在國內(nèi)屬易于購買使用的吸入麻醉藥，故作者選擇異氟烷作為吸入麻醉藥物。為保證麻醉效果適于手術(shù)并且不會因麻醉程度過深影響手術(shù)操作，采用了戊巴比妥鈉誘導(dǎo)麻醉與異氟烷吸入維持麻醉結(jié)合的方法。在靜注戊巴比妥鈉時盡可能地緩慢推注并觀察猴的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)猴針刺反射消失，肌肉松弛即刻停止推注，盡快完成備皮操作與手術(shù)臺固定，并更換異氟烷吸入維持麻醉，吸入麻醉的初期若出現(xiàn)四肢的肌肉活動，則增加異氟烷的蒸發(fā)速度，待猴進(jìn)入穩(wěn)定的適合手術(shù)狀態(tài)后，逐漸減少異氟烷的蒸發(fā)速度，并在整個手術(shù)過程中保持觀察猴的麻醉狀態(tài)并調(diào)節(jié)異氟烷蒸發(fā)速度。

3.2.4恒河猴皮下脂肪少，故切開皮膚時應(yīng)避免用力過猛導(dǎo)致切到肌肉組織，考慮到術(shù)后創(chuàng)口愈合的速度與縫合方法的要求，作者選擇手術(shù)刀作切口，僅使用雙極電凝器止血。

3.2.5作者進(jìn)行該試驗之前，進(jìn)行過8例Beagle犬的植入手術(shù)，雖出現(xiàn)過個別犬因為抓撓傷口自拆線導(dǎo)致創(chuàng)口開裂，需要重新清創(chuàng)縫合、延長術(shù)后護(hù)理期的個例，但犬身體結(jié)構(gòu)與活動方式與猴不同，在使用縫合方法時，一般無需考慮自拆線的可能性，皮膚縫合時應(yīng)用非吸收線間段縫合法即可。并且犬皮下脂肪層較猴多，脂肪層血管分布豐富，在術(shù)中分離脂肪層易出血，術(shù)后愈合時傷口區(qū)域的脂肪組織也容易出現(xiàn)液化，嚴(yán)重時需要引流，并且會延長愈合時間。但猴的受術(shù)區(qū)域基本無脂肪分布，只需切開后及時止血即可；考慮到恒河猴的依從性極差，前后肢動作靈活與人相似，術(shù)后一旦恢復(fù)活動能力，猴的自發(fā)活動與猴對正常的飼養(yǎng)、護(hù)理等操作的應(yīng)激反應(yīng)，可能會出現(xiàn)傷口崩裂或擅自拆線行為，對傷口的恢復(fù)有一定的影響。所以作者除了選擇牢固、可吸收的縫合線之外，在縫合時適當(dāng)減小針距，減少傷口崩裂的可能，并且縫合皮膚時，所有切口均用皮內(nèi)連續(xù)縫合法縫合皮膚，不再暴露縫線，縫合后傷口閉合牢固，避免了猴抓撓傷口，撕拉縫線的可能性。

3.2.6因植入子本體與股動脈插管之間的壓力導(dǎo)管的通道是用醫(yī)用不銹鋼中空管鈍性分離建立的，該通道對應(yīng)位置的水腫/血腫基本上在術(shù)后24 h左右才開始出現(xiàn)。其原因可能是建立通道時損傷的小血管雖然有破損，但因為手術(shù)期間猴屬固定狀態(tài)，并且麻醉時血壓偏低，術(shù)后則因為蘇醒和恢復(fù)活動需要一定時間，待猴可以自由活動后，壓力導(dǎo)管通道區(qū)域開始滲液/出血，導(dǎo)致水腫/血腫出現(xiàn)，但因為無感染，止血后被自體吸收即恢復(fù)正常。