米糠蛋白的超聲改性及在亞麻籽油微膠囊中的應(yīng)用研究

?；勖簦锷倬?，丁芳芳

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

亞麻籽油富含ω-3必需脂肪酸，具有預(yù)防冠心病、癌癥、神經(jīng)和激素紊亂等功能[1]，但是其氧化穩(wěn)定性差，采用噴霧干燥法將亞麻籽油制成微膠囊是避免脂質(zhì)酸敗的有效方法。碳水化合物如麥芽糊精、阿拉伯樹膠等具有溶解性好、高濃度下黏度低等特性，是制備微膠囊的常用壁材，但其乳化性能較差，不能較好地包埋疏水性芯材。多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合，具有良好的乳化性能，而且制備的微膠囊能夠承受各種加工條件如pH值、溫度和離子強(qiáng)度的變化[2]。Karaca等[3]以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的鷹嘴豆或扁豆分離蛋白和35.5%的麥芽糊精為復(fù)合壁材，包埋10.5%的亞麻籽油，制備的微膠囊包埋率達(dá)到最高，并且復(fù)溶后液滴粒徑較小。

米糠蛋白具有易消化、不易致敏和抗癌等特性，但是表面疏水性較低，導(dǎo)致其在兩相界面上吸附能力變差[4]；米糠蛋白乳化穩(wěn)定性較好，但乳化活性較差[5]。超聲波具有穿透力好、受力均勻性好等特點(diǎn)，有研究表明，米糠蛋白經(jīng)超聲改性后溶解性、乳化性和起泡性得到明顯的改善[6-7]。

作者首先優(yōu)化米糠蛋白的超聲改性工藝條件，以獲得具有較好乳化性的蛋白，然后與麥芽糊精按適當(dāng)比例復(fù)配充當(dāng)壁材，包埋亞麻籽油。研究改性蛋白對(duì)微膠囊粉末油脂包埋率、復(fù)溶后粒徑和電位、微觀結(jié)構(gòu)的影響，并分析其中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，為開發(fā)新型微膠囊壁材和擴(kuò)大亞麻籽油的應(yīng)用范圍提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

米糠蛋白：自制(蛋白含量60.35%±0.31%)；大豆油：山東萬德福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；亞麻籽油：低溫冷榨，呼和浩特市維拓食品有限公司；麥芽糊精：BR級(jí)，北京索萊寶科技有限公司；單甘酯：食品級(jí)，臨沂森普食品有限公司；其他試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

K1160全自動(dòng)凱式定氮儀：山東海能科學(xué)儀器有限公司；高速剪切乳化機(jī)：德國FLUKO流體機(jī)械制造公司；高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；722S可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；PHS-3C型精密酸度計(jì)：上海大普儀器有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；S-3400 N掃描式電子顯微鏡：日本Hitachi公司；Zetasizer NanoZS90 激光粒度儀：英國Malvern 儀器有限公司；傅立葉紅外光譜儀：美國NICOLET公司；小型臺(tái)式噴霧干燥機(jī)：瑞士 Buchi 實(shí)驗(yàn)室儀器公司；熒光分光光度計(jì)RF-5301：日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲改性米糠蛋白

配置一定質(zhì)量濃度的米糠蛋白溶液，調(diào)pH值至 7，室溫下磁力攪拌2 h。超聲過程中，始終控制蛋白溶液溫度在35 ℃以下，設(shè)置功率和時(shí)間，超聲處理程序?yàn)樘幚? s，停2 s。一部分使用蒸餾水稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，測(cè)定其溶解度和乳化性，另一部分經(jīng)冷凍干燥后測(cè)定結(jié)構(gòu)。

1.3.2 溶解度的測(cè)定

用移液槍吸取10 mL超聲改性米糠蛋白于燒杯中，4 500 r/min下離心20 min。吸取4 mL上清液，參考GB/T 5009—2010測(cè)定蛋白質(zhì)含量，溶解度計(jì)算公式如下：

1.3.3 乳化性的測(cè)定

乳化性的測(cè)定參考Phongthai等[8]的方法，略有改動(dòng)。用移液槍吸取一定量的超聲改性米糠蛋白于50 mL離心管中，調(diào)節(jié)pH值為8，將蛋白溶液和大豆油按體積比1∶3混合，室溫下磁力攪拌30 min，使用10 000 r/min的均質(zhì)剪切機(jī)剪切1 min，立即從容器底部吸取50 μL混合液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS溶液稀釋100倍，于波長(zhǎng)500 nm下測(cè)定吸光值(A0)，10 min后再次測(cè)定吸光值(A10)。乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)計(jì)算公式如下：

式中：N為稀釋倍數(shù)，100；C為水溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，1 g/100 mL；φ=0.25，水溶液中油的體積分?jǐn)?shù)。

1.3.4 微膠囊粉末油脂的制備工藝

微膠囊粉末油脂的制備參考Karaca等[3]的方法，略有改動(dòng)。按照表1準(zhǔn)確稱料后，使水相混合物(蒸餾水、麥芽糊精、改性米糠蛋白)完全溶解，在65 ℃下使油相混合物(亞麻籽油、單甘酯)充分分散，二者混合并乳化30 min，然后在均質(zhì)壓力40 MPa下循環(huán)2次，制得的料液在進(jìn)風(fēng)溫度為180 ℃、出風(fēng)溫度為90～110 ℃的條件下噴霧干燥制得亞麻籽油粉末油脂。

表1 微膠囊粉末油脂配方Table 1 Formula of microcapsulated powder oil g

1.3.5 微膠囊粉末油脂表面含油量的測(cè)定

參照張雪春等[9]的方法，稍做修改。稱取2 g樣品(m)于錐形瓶中，加入40 mL石油醚，攪拌2 min，過濾到圓底燒瓶中，回收濾液中的石油醚，烘干至恒質(zhì)量，計(jì)算表面油脂的質(zhì)量(m1)。

1.3.6 微膠囊粉末油脂總油量的測(cè)定

參照李堅(jiān)仁等[10]的方法，稍做修改。準(zhǔn)確稱取1 g樣品置于100 mL錐形瓶中，加入10 mL鹽酸，75 ℃水浴中振蕩10 min，再加入10 mL乙醇，冷卻后加25 mL石油醚，靜置后吸出上清液，再經(jīng)石油醚重復(fù)提取2次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收石油醚，并烘至恒質(zhì)量，根據(jù)質(zhì)量變化計(jì)算粉末油脂產(chǎn)品的含油量。

1.3.7 微膠囊粉末油脂包埋率的計(jì)算

1.3.8 微膠囊粉末油脂復(fù)溶后的粒徑測(cè)定

參考Shao等[11]的方法，略有改動(dòng)。用蒸餾水將兩種微膠囊粉末油脂稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%，采用激光粒度儀測(cè)定乳液粒徑，以乳液粒度分布為指標(biāo)記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.9 微膠囊粉末油脂復(fù)溶后的zeta-電位測(cè)定

參考Shao等[11]的方法，略有改動(dòng)。用蒸餾水將兩種微膠囊粉末油脂稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.005%，采用激光粒度儀測(cè)定乳液電位(25 ℃)。

1.3.10 微膠囊粉末油脂微觀結(jié)構(gòu)的觀察

利用掃描電子顯微鏡觀察微膠囊粉末油脂的微觀結(jié)構(gòu)，參照李偉偉[12]的方法，稍做修改。設(shè)置加速電壓為3 kV，放大倍數(shù)2 000～5 000倍。

1.3.11 傅立葉紅外光譜分析

微膠囊粉末油脂樣品和KBr按1∶100混合，研磨均勻后進(jìn)行壓片。以純KBr為參照樣，在波數(shù)400～4 000 cm-1下進(jìn)行傅立葉紅外掃描。對(duì)紅外吸收曲線進(jìn)行二級(jí)求導(dǎo)，光譜數(shù)據(jù)用Peakfit 4.12軟件進(jìn)行分析。

1.3.12 游離巰基、二硫鍵含量的測(cè)定

參考吳偉等[14]的方法，略有改動(dòng)。采用 5，5′-二硫代二硝基苯甲酸鹽比色法測(cè)定米糠蛋白總巰基和游離巰基含量，以13 600 mol/(L·cm)消光系數(shù)進(jìn)行計(jì)算。總巰基與游離巰基差值的一半即為二硫鍵含量。

1.3.13 表面疏水性的測(cè)定

參考吳偉等[14]的方法，略有改動(dòng)。取100 mg米糠蛋白溶解于0.01 mol/L、pH 7的磷酸鹽緩沖液中，室溫下磁力攪拌2 h后5 000 r/min離心20 min，收集上清液。用磷酸鹽緩沖液將蛋白質(zhì)量濃度稀釋為0.005、0.125、0.245、0.365、0.485 mg/mL。取4 mL上清液，加入20 μL的0.008 mol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸，混合均勻，在激發(fā)波長(zhǎng)390 nm和發(fā)射波長(zhǎng)470 nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)量濃度作圖，采用最小二乘法進(jìn)行曲線擬合，直線斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用 SPSS 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，使用Duncan’s進(jìn)行多重比較。采用Origin 8.5軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠蛋白超聲改性的工藝優(yōu)化

2.1.1 超聲功率密度對(duì)米糠蛋白溶解性和乳化性的影響

在超聲時(shí)間30 min、蛋白質(zhì)量濃度4 g/100 mL的條件下，研究超聲功率密度對(duì)米糠蛋白溶解性、乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖1。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，圖2、圖3同。圖1 超聲功率密度對(duì)米糠蛋白溶解性和乳化性的影響Fig.1 Effect of power density on the solubility and emulsibility of rice bran protein

由圖1可知，在超聲功率密度5 W/mL時(shí)米糠蛋白的溶解度、乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性均達(dá)到最大值。繼續(xù)增加功率密度，溶解度降低，這可能由于此時(shí)超聲促使米糠蛋白暴露出更多的疏水性基團(tuán)，疏水相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致不溶性小聚集體的產(chǎn)生[15]，進(jìn)而降低蛋白乳化性。因此，選擇功率密度為5 W/mL。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)米糠蛋白溶解性和乳化性的影響

在超聲功率密度5 W/mL，蛋白質(zhì)量濃度4 g/100 mL的條件下，研究超聲時(shí)間對(duì)米糠蛋白溶解性、乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)米糠蛋白溶解性和乳化性的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the solubility and emulsibility of rice bran protein

由圖2可知，米糠蛋白溶解度隨超聲時(shí)間增大而增大，這與Nazari等[16]研究超聲改性小米濃縮蛋白的結(jié)果一致。超聲30 min時(shí)米糠蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性均達(dá)到最高。這與王長(zhǎng)遠(yuǎn)等[7]的研究結(jié)果一致。因此，選擇超聲時(shí)間為30 min。

2.1.3 蛋白質(zhì)量濃度對(duì)米糠蛋白溶解性和乳化性的影響

在超聲功率密度5 W/mL，超聲時(shí)間30 min的條件下，研究蛋白質(zhì)量濃度對(duì)米糠蛋白溶解性、乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，米糠蛋白溶解度在質(zhì)量濃度為4 g/100 mL時(shí)達(dá)到最大值，隨后出現(xiàn)了急劇下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)榇藭r(shí)液體黏稠性增強(qiáng)，嚴(yán)重影響了超聲產(chǎn)生的空化效果。乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性在蛋白質(zhì)量濃度為4 g/100 mL時(shí)均達(dá)到最大值，可能是在低濃度下超聲促使米糠蛋白暴露出更多的親水和疏水性基團(tuán)，也可能是由于蛋白粒徑減小，能夠快速地吸附到界面上，降低界面張力，使乳化性得到改善。因此，選擇蛋白質(zhì)量濃度為4 g/100 mL。

2.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)條件為超聲功率密度5 W/mL、超聲時(shí)間30 min、蛋白質(zhì)量濃度4 g/100 mL，并對(duì)比了改性前后米糠蛋白的溶解度和乳化性，結(jié)果見表2。

由表2可知，超聲改性后米糠蛋白溶解度顯著提高了171.06%，可能是因?yàn)槌曁幚泶偈姑卓返鞍琢綔p小，與水分子之間的接觸面積增加[17]；乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性分別顯著提高了60.4%和107.79%，可能是由于超聲使蛋白分子結(jié)構(gòu)部分展開，導(dǎo)致更多的分子聚集到油-水界面上，形成較厚的內(nèi)聚性膜。

圖3 蛋白質(zhì)量濃度對(duì)米糠蛋白溶解性和乳化性的影響Fig.3 Effect of the mass concentration of protein on the solubility and emulsibility of rice bran protein

表2 改性前后米糠蛋白溶解度和乳化性的對(duì)比
Table 2 Comparison of solubility and emulsibility
of rice bran protein before and after modification

樣品溶解度/%乳化活性指數(shù)/(m2·g-1)乳化穩(wěn)定性/min米糠蛋白29.16±1.2812.45±0.4080.97±3.10超聲改性米糠蛋白79.04±0.6619.97±0.17168.25±3.32

2.2 改性前后米糠蛋白二硫鍵含量和表面疏水性分析

由表3可知，米糠蛋白超聲改性后二硫鍵含量降低，可能是超聲產(chǎn)生的空化作用打斷了二硫鍵，使得蛋白結(jié)構(gòu)展開，極性基團(tuán)朝向水相，溶解度增大，進(jìn)而改善了乳化性[18]。從圖2和表3可知，盡管超聲改性后米糠蛋白表面疏水性增強(qiáng)，但溶解度遠(yuǎn)高于對(duì)照樣，可能原因是超聲破壞了蛋白分子之間的靜電引力，導(dǎo)致蛋白分子分散，不易聚集，進(jìn)而引起溶解度增大[19]，改善了乳化性。除此之外，表面疏水性也同樣重要，因?yàn)榇罅康氖杷曰鶊F(tuán)有利于蛋白質(zhì)膠束的形成，使其更好地吸附和保留在油-水界面上。

表3 改性前后米糠蛋白二硫鍵含量和表面疏水性Table 3 Disulfide bond contents and surface hydrophobicity of rice bran protein before and after modification

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，表4、表5同。

2.3 微膠囊粉末油脂表面含油量和包埋率分析

由表4可知，添加超聲改性米糠蛋白的微膠囊粉末油脂表面含油量顯著低于添加對(duì)照樣的，而包埋率顯著增高?？赡苁且?yàn)槊卓返鞍捉?jīng)超聲改性后乳化性得到改善，使得在噴霧干燥時(shí)易形成致密的保護(hù)膜[20]。此外，黏度是微膠囊化過程中需要控制的重要參數(shù)，它可以影響干燥過程中乳液的穩(wěn)定性和流動(dòng)行為，進(jìn)料黏度較高時(shí)會(huì)延長(zhǎng)干燥過程，形成細(xì)長(zhǎng)顆粒，導(dǎo)致顆粒中含有空氣，進(jìn)而影響油的包埋效果，這與Chang等[21]的研究結(jié)果一致。樣品2在噴霧干燥之前黏度降低可能是由超聲降低蛋白粒徑引起的。

表4 微膠囊粉末油脂表面含油量和包埋率Table 4 Surface oil content and encapsulation rate of microcapsulated powder oil %

注：樣品1為添加米糠蛋白微膠囊粉末油脂；樣品2為添加超聲改性米糠蛋白微膠囊粉末油脂，圖4、圖5、表5同。

2.4 微膠囊粉末油脂的微觀結(jié)構(gòu)分析

注：a為樣品1；b為樣品2。圖4 微膠囊粉末油脂群體的掃描電子顯微鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy of microcapsulated powder oil group

兩種微膠囊粉末油脂群體掃描電子顯微鏡圖見圖4。樣品1群體圖像顆粒黏結(jié)現(xiàn)象較嚴(yán)重并有破裂顆粒。樣品2黏著現(xiàn)象不明顯，壁材完整，基本無破裂現(xiàn)象，并且顆粒較小，有利于其在溶液中溶解。這與表4顯示樣品2包埋率較高，樣品1包埋率較低的結(jié)果一致。

2.5 微膠囊粉末油脂復(fù)溶后的粒徑和zeta-電位

兩種微膠囊粉末油脂復(fù)溶后的粒徑見圖5。樣品1和2復(fù)溶后zeta-電位分別為(-23.9±0.17) V和(-25.9±0.43) V。乳液粒徑大小和帶電量與乳液穩(wěn)定性有關(guān)。由圖5可知，相對(duì)于樣品1，樣品2復(fù)溶后乳滴粒徑分布圖向粒徑小的方向移動(dòng)，這可能是由于樣品2油滴的zeta-電位較高，使得油滴不易聚集。

圖5 微膠囊粉末油脂復(fù)溶后的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of dissolved microcapsulated powder oil

2.6 微膠囊粉末油脂中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化分析

由表5可知，與樣品1的蛋白相比，樣品2蛋白的β-轉(zhuǎn)角含量增加，分子柔性增大，蛋白吸附界面后構(gòu)象易發(fā)生變化[22]。α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，說明蛋白質(zhì)可能和麥芽糊精通過氫鍵發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)[23]。同時(shí)α-螺旋具有兩親性，促進(jìn)蛋白在界面上迅速吸附和定向排布[24]。表明樣品2復(fù)溶后具有較好的乳化性。

表5 微膠囊粉末油脂中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Table 5 The secondary structure changes of protein in microcapsulated powder oil %

3 結(jié)論

研究表明，當(dāng)超聲功率密度5 W/mL、超聲時(shí)間30 min、蛋白質(zhì)量濃度4 g/100 mL時(shí)，改性米糠蛋白的溶解度、乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性分別提高了171.06%、60.4%和107.79%。超聲改性后，米糠蛋白二硫鍵斷裂，多肽鏈伸展，分子內(nèi)部的疏水性氨基酸得以暴露，乳化性得到改善。

添加超聲改性米糠蛋白制備的粉末油脂包埋率增大，復(fù)溶后粒徑減小，凈電荷量升高。SEM圖像顯示，微膠囊粉末油脂表面光滑連續(xù)并且顆粒較小，其中的蛋白質(zhì)β-轉(zhuǎn)角含量較高，分子柔性增大，乳化性得到提高。