哈密大棗中環(huán)磷酸腺苷的分離純化工藝研究

于佳佳，陳愷

（1.新疆職業(yè)大學烹飪與餐飲管理學院，新疆烏魯木齊830013；2.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052）

環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）是細胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和生物學功能的重要物質(zhì)，是生命信息傳遞的“第二信使”[1]。在體內(nèi)可以促進心肌細胞的存活，改善心肌缺氧的作用[2]。增強心肌細胞抗損傷、抗缺血和缺氧能力；促進鈣離子向心肌細胞內(nèi)流動，增強磷酸化作用，促進興奮-收縮偶聯(lián)，提高心肌細胞收縮力，增加心輸出量；同時還擴張外周血管，降低心臟射血阻抗，減輕心臟前后負荷，增加心排出量，改善心功能[3-4]。對心臟起到營養(yǎng)心肌、正性肌力、舒張血管、抗血小板凝聚和抗心律失常的作用。紅棗中 cAMP 含量高達 100 nmol/g～600 nmol/g[5]，是180 多種已測高等植物中含量最高的植物品種。新疆紅棗栽培面積近50 萬公頃，產(chǎn)量達300 萬噸[6]。哈密地區(qū)日照時數(shù)之長，晝夜溫差之大，日照率之高，為新疆乃至全國之最。目前，國外的cAMP 產(chǎn)品主要是從動物的內(nèi)臟中提取，其成本較高，產(chǎn)量也較少[7-9]。本文以哈密大棗為研究材料，采用大孔樹脂對哈密大棗提取液中cAMP 的分離純化工藝進行研究，為哈密大棗以及其他棗品種的精深加工及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

哈密大棗：干棗，購于北園春干果市場。cAMP 標準品（純度≥99%）：中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純）、磷酸二氫鉀（優(yōu)級醇）、無水乙醇（分析純）、氨水（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；離子交換樹脂、D-101、HZ-802、AB-8 型大孔吸附樹脂：艾美科健（中國）生物醫(yī)藥有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：[包括SPD-20A 紫外檢測器、LC-20AB 高壓恒流泵、CTO-10AS 恒溫柱溫箱、Brava-BDS C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）]：日本島津公司；SHB-111 循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ5200 超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；AL204-IC 電子天平、FE20K-Plus pH 計：梅特勒-托利多儀器有限公司；JY2002 電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；HH-S 恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；TDSA-WS 低速離心機：湘儀離心機儀器有限公司；燒瓶、三角瓶、玻璃棒。

1.3 方法

1.3.1 分離純化工藝流程

提取液→大孔吸附樹脂吸附→洗脫→真空冷凍干燥→哈密大棗cAMP 粗品

1.3.2 上樣液的制備

將哈密大棗去核后，粉碎干燥過60 目篩至恒重，放置干燥器中備用，以1 ∶10（g/mL）的料液比加入蒸餾水，80 ℃水浴加熱4 h，過濾后真空濃縮備用。

1.3.3 色譜條件

前期研究結(jié)果顯示[10]，高效液相色譜測定條件為流動相為甲醇∶0.05 mol/L 磷酸二氫鉀，體積比=10 ∶90，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：20 μL，檢測波長：256 nm。

1.3.4 樹脂預(yù)處理與活化

分別稱取大孔吸附樹脂HZ-802（非極性）、D101（非極性）、AB-8（弱極性）、離子交換型樹脂各5 g 置于150 mL 三角瓶中，加入50 mL 95%乙醇溶液，進行搖床，條件為 20 ℃、180 r/min，搖床 24 h，使樹脂充分活化。取出后濾去乙醇溶液，用4%氫氧化鈉浸泡3 h 后用水沖洗至中性，再用2%鹽酸浸泡3 h 后用水沖洗至中性后去離子超純水保存待用[11-12]。

1.3.5 樹脂的篩選

取上述活化后洗至中性的4 種樹脂，濾去超純水后各加入50 mL 哈密大棗提取液，進行搖床，條件為20 ℃、180 r/min，搖床 24 h，使其充分進行靜態(tài)吸附。取上清液，過0.45 nm 濾膜，高效液相色譜測定cAMP 含量[13]，計算吸附率。根據(jù)測定結(jié)果分別計算4 種樹脂的靜態(tài)吸附率和解吸率。計算公式為：

式中：C0為提取液 cAMP 濃度，mg/mL；C1為吸附后溶液中cAMP 濃度，mg/mL；C2為解吸附后溶液中cAMP 濃度，mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂篩選試驗

2.1.1 靜態(tài)吸附試驗

精密量取預(yù)處理好的4 種大孔吸附樹脂各20.00 g（濕重）置于三角瓶中，加入上樣液200 mL，密封，于振蕩器（20 ℃，180 r/min）中振蕩，使其充分吸附，12 h 取上清液，檢測溶液中cAMP 含量，計算其吸附率。試驗結(jié)果見圖1。

圖1 不同樹脂對哈密大棗cAMP 的靜態(tài)吸附率Fig.1 Results of static adsorption of different macroporous resins to cAMP from Hami jujube

圖1 結(jié)果表明，離子交換樹脂對cAMP 的吸附效果較差，吸附率僅為7%左右，D101 型和AB-8 型樹脂對cAMP 的吸附效果較好，吸附率分別為28.19%和29.95%，HZ-802 型樹脂的吸附率在4 種樹脂中最高，吸附率為38.64%。

2.1.2 解吸試驗

通過吸附試驗得知離子交換型樹脂的吸附效果差，所以沒有對離子交換樹脂進行解吸試驗。取充分吸附后的3 種樹脂，過濾，分別取50 mL 20%乙醇和氨水作為洗脫劑，進行搖床解吸，條件為20 ℃、180 r/min，搖床24 h，使其充分進行解吸，取上清液，過0.45 μm濾膜，高效液相色譜測cAMP 含量，計算解吸率。試驗結(jié)果見圖2。

圖2 不同樹脂對哈密大棗cAMP 的解吸率Fig.2 Results of static desorption of cAMP from Hami jujube from different macroporous resins

圖2 結(jié)果表明，通過20%乙醇洗脫劑進行解吸時，HZ-802 型樹脂的解吸效果在3 種樹脂中最差，解吸率為71.95%。D101 型樹脂的解吸率最高，解吸率為85.15%。AB-8 型樹脂的解吸率與D101 型相差不大，解吸率為84.55%。3 種樹脂使用20%乙醇洗脫劑的洗脫效果均高于氨水洗脫劑，所以選擇20%乙醇作為洗脫劑。結(jié)合吸附率試驗，HZ-802 樹脂的吸附效果較好，故選用HZ-802 型樹脂吸附，20%乙醇溶液作為洗脫劑進行后續(xù)試驗。

2.2 HZ-802型樹脂對哈密大棗cAMP動態(tài)吸附試驗

2.2.1 泄露曲線的研究

泄漏曲線的測定可以確定動態(tài)吸附時的上樣體積。取充分活化后洗至中性的HZ-802 型樹脂25.00 g，填裝入層析柱，選擇上樣液cAMP 濃度15 μg/mL，pH 5，流速1.0 mL/min，進行分管收集，每管收集20 mL，過0.45 nm 濾膜，進高效液相色譜測定cAMP 的濃度。試驗結(jié)果見圖3。

圖3 HZ-802 型樹脂對哈密大棗cAMP 的吸附泄露曲線Fig.3 Leak curve of HZ-802 resin adsorbing cAMP from Hami jujub

圖3 結(jié)果表明，當收集到第10 管時，可以測得cAMP 含量為 7.94 μg/mL，且后續(xù)收集管 cAMP 含量呈增長趨勢，所以確定此點為泄漏點，最大上樣體積確定為220 mL。

2.2.2 流速的選擇

取充分活化后洗至中性的HZ-802 型樹脂25.00 g，填裝入層析柱，選擇上樣液的流速分別為1、1.5、2、2.5、3 mL/min，上樣液 cAMP 濃度 15 μg/mL，pH 5，上樣體積為220 mL 進行動態(tài)吸附，收集流出液過0.45 μm濾膜，進高效液相色譜測定cAMP 的濃度，計算吸附率。結(jié)果見圖4。

圖4 上樣液流速對樹脂吸附率的影響Fig.4 Effects of flow rate of sample solution on adsorption rate of HZ-802 resin

圖4 結(jié)果表明，在低流速時，HZ-802 型樹脂對cAMP 的吸附效果較好，可能是由于上樣液在柱中時間更長，有利于樹脂的充分吸附，流速越慢吸附所需要的時間也越長。流速為1.0 mL/min 時樹脂的吸附效果最好，吸附率為97.94%。流速在1.5 mL/min 時的吸附率為96.27%，流速在2.0 mL/min 的吸附率為96.18%，流速在 2.5 mL/min 時，HZ-802 型樹脂對 cAMP 的吸附率有明顯的下降，吸附率降為92.83 %。流速在3.0 mL/min 時吸附率為89.42%。綜合時間、吸附效率考慮，選擇上樣液流速為2.0 mL/min。

2.2.3 上樣液濃度的選擇

取充分活化后洗至中性的HZ-802 型樹脂25.00 g，填裝入層析柱，調(diào)節(jié)上樣液cAMP 濃度分別5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL，上樣液 pH 5，上樣液流速2.0 mL/min，上樣體積為220 mL 進行動態(tài)吸附，收集流出液過0.45 nm 濾膜，進高效液相色譜測定cAMP的濃度，計算吸附率。結(jié)果見圖5。

圖5 上樣液濃度對樹脂吸附率的影響Fig.5 Effects of cAMP concentration of sample solution on adsorption rate of HZ-802 resin

圖5 結(jié)果表明，低濃度的上樣液更容易讓HZ-802 型樹脂對cAMP 進行吸附，隨著上樣液濃度的升高，樹脂對cAMP 的吸附效果逐漸降低。上樣液cAMP濃度在5 μg/mL 時吸附率最大，吸附率為97.77%。上樣液濃度在 10、15、20、25 μg/mL4 個濃度吸附率較高且相差不大，吸附率分別為96.77%、96.18%、95.82%、95.85%。當 cAMP 濃度高于 25 μg/mL 時，樹脂對cAMP的吸附率則隨著上樣液中cAMP 濃度的升高而有明顯降低，濃度在 30、35、40 μg/mL 時吸附率為 92.69%、91.35%、90.65%。所以選擇上樣液濃度為25 μg/mL。

2.2.4 上樣pH 值選擇

取充分活化后洗至中性的HZ-802 型樹脂25.00 g，填裝入層析柱，選擇大棗提取液的上樣pH 值分別為3、4、5、6、7、8，上樣液 cAMP 濃度 25 μg/mL，上樣液流速2.0 mL/min，上樣體積為220 mL 進行動態(tài)吸附，收集流出液過0.45 nm 濾膜，進高效液相色譜測定cAMP的濃度，計算吸附率。結(jié)果見圖6。

圖6 上樣液pH 值對樹脂吸附率的影響Fig.6 Effects of sample solution pH value on adsorption rate of HZ-802 resin

圖6 結(jié)果表明，pH 值對樹脂吸附cAMP 有很大影響，上樣pH 3 時不利于樹脂對cAMP 的吸附，吸附率最低為81.18%。隨著pH 值升高吸附率略有提升，在pH 4、5、6 時的吸附率為 94.98%，95.13%、95.69%。當pH 值繼續(xù)升高，樹脂對cAMP 的吸附率則隨著pH 值升高而略有降低，pH 7、8 的吸附率分別為94.32%和93.70%。綜上所述，上樣pH 值選擇為pH 6。通過單因素試驗，確定HZ-802 型樹脂的吸附條件為上樣流速2.0 mL/min，上樣濃度 25 μg/mL，上樣 pH 6。

2.2.5 正交試驗

通過單因素試驗確定的條件，進行正交試驗。對上樣液流速、濃度、pH 值3 個因素，每個因素3 個水平，采用L（933）正交表設(shè)計正交試驗，見表1。

表1 L9（33）正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of L9（33）orthogonal test

表2 正交試驗結(jié)果及極差分析Table 2 Results of L9（33）orthogonal experimental and range analysis

正交試驗極差分析得到結(jié)果，HZ-802 型樹脂吸附cAMP 的最佳因素為上樣液流速為2.0 mL/min，上樣液濃度20 μg/mL，pH 5，吸附率為98.50%。對此結(jié)果進行驗證試驗，得到結(jié)果見表3。

表3 驗證試驗Table 3 Verification test

驗證試驗結(jié)果證明，通過3 次水平試驗驗證了正交試驗得到的條件為HZ-802 型樹脂吸附cAMP 的最佳條件，即上樣液流速2.0 mL/min，上樣液濃度20 μg/mL，pH 5，吸附率為98.50%。

2.3 HZ-802型樹脂對哈密大棗cAMP動態(tài)解吸試驗

2.3.1 洗脫曲線

洗脫曲線的測定可以確定動態(tài)解析時的洗脫液體積。取充分活化后洗至中性的HZ-802 型樹脂25.00 g，填裝入層析柱，選擇大棗提取液的上樣液流速2.0 mL/min、濃度 20 μg/mL、pH 5，上樣體積 220 mL 進行吸附。充分吸附后用洗脫液20%乙醇溶液，洗脫液流速1.0 mL/min 進行洗脫，分管收集，每管收集20 mL，過0.45 μm 濾膜，高效液相色譜測定cAMP 的濃度。試驗結(jié)果見圖7。

圖7 洗脫曲線Fig.7 Elution curve of cAMP

圖7 結(jié)果表明，當收集至第3 管洗脫液時，可以測得cAMP 的含量最高，當收集至第5 管洗脫液時，洗脫液中已經(jīng)未測到cAMP 含量，所以確定洗脫液用量體積定為120 mL。

2.3.2 洗脫液流速的選擇

取充分活化后洗至中性的HZ-802 型樹脂25.00 g，填裝入層析柱，選擇大棗提取液的上樣液流速2.0 mL/min、濃度 20 μg/mL、pH 5，上樣體積 220 mL進行吸附。充分吸附后用洗脫液20%乙醇溶液，以洗脫液流速 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min，洗脫液體積 120 mL進行洗脫，收集洗脫液過0.45 nm 濾膜，進高效液相色譜測定cAMP 含量，計算解吸率。試驗結(jié)果見圖8。

圖8 洗脫流速對樹脂解吸率的影響Fig.8 Effects of flow rate of eluent on desorption rate of cAMP from HZ-802 resin

圖8 結(jié)果表明，洗脫液的流速過高或者過低對解吸都有很大的影響。洗脫液流速1.0 mL/min 時解吸效果較差，解吸率為88.16%。流速過高時可能由于洗脫液下降過快，與樹脂沒能完全接觸，導致沒有完全洗脫，所以解吸率低。當洗脫液流速為5.0 mL/min 時，解吸率為88.45 %。洗脫液流速控制在2.0 mL/min 和3.0 mL/min 時解吸效果較好，解吸率為92.59 %和93.25%。故選擇洗脫液流速為3.0 mL/min。

2.3.3 洗脫液濃度的選擇

取充分活化后洗至中性的HZ-802 型樹脂25.00 g，填裝入層析柱，選擇大棗提取液的上樣液流速2.0 mL/min，濃度 20 μg/mL，pH 5，上樣體積 220 mL 進行吸附。充分吸附后用洗脫液濃度為10%、20%、30%、40%、50%乙醇溶液，洗脫液流速3.0 mL/min，洗脫液體積120 mL 進行洗脫，收集洗脫液過0.45 nm 濾膜，進高效液相色譜測定cAMP 含量，計算解吸率。試驗結(jié)果見圖9。

圖9 乙醇濃度對樹脂解吸率的影響Fig.9 Effects of ethanol concentration as eluent on desorption rate of cAMP from HZ-802 resin

圖9 結(jié)果表明，乙醇濃度的大小對于cAMP 的解析效果有明顯影響，隨著乙醇濃度的提高分離效果也隨之提高，以40%乙醇洗脫效果最佳。乙醇能與水以任意比互溶，乙醇溶液中醇濃度越高，極性越弱，越有利于cAMP 這種弱極性物質(zhì)的洗脫。當洗脫液為10%乙醇時的解吸效果較差，解吸率為79.01%。而洗脫液為50 %乙醇時的解吸效果也相對較差，解吸率為87.78%。當乙醇濃度為20%、30%、40%時，解吸率隨著濃度的升高而略微升高，分別為92.59%、93.47%、97.32%。綜上所述，洗脫液為40%乙醇溶液對cAMP 的解吸效果最佳，故選擇洗脫液濃度為40%乙醇溶液[14]。

2.4 粗提物的測定

根據(jù)上樣液濃度與洗脫液濃度計算，得到HZ-802型樹脂對cAMP 的純化倍數(shù)為1.76 倍。取大孔吸附樹脂純化后的粗提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，在-70 ℃冰箱內(nèi)冷凍過夜，于冷凍干燥機進行干燥，干燥參數(shù)為：-20 ℃、12 h→ 0 ℃、6 h→10 ℃、3 h→30 ℃、4 h，得到粗提物粉末。精密稱取1 g 粗提物粉末，定容至100 mL容量瓶，過0.45 μm 濾膜，高效液相色譜測定cAMP 含量，計算的粗提物中cAMP 含量為0.10%，試驗結(jié)果與尤妍等哈密大棗中粗提液純化干燥后cAMP 含量保持一致[15-17]。

3 結(jié)論

1）試驗通過靜態(tài)吸附解吸試驗，篩選出對cAMP吸附和解吸效果最佳的樹脂HZ-802。

2）HZ-802 型樹脂對哈密大棗cAMP 動態(tài)吸附的最佳條件為：上樣液流速2.0 mL/min，上樣液濃度20 μg/mL，上樣液 pH 5，吸附率為 98.50%。

3）HZ-802 型樹脂對哈密大棗cAMP 動態(tài)解吸的最佳條件為：洗脫劑40%乙醇，洗脫劑流速3.0 mmL/min，洗脫液用量體積為120 mL，解吸率為97.32%。

4）冷凍干燥后粗提物中cAMP 含量為0.10%。