產(chǎn)κ-卡拉膠裂解酶菌株的篩選與鑒定

吳家葳， 張文靜， 遲乃玉， 王曉輝

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連116622）

卡拉膠（Carrageenan），又被稱為石花菜膠、鹿角菜膠、角叉菜膠等，是一種親水性較高的大分子多糖，它由半乳糖硫酸酯鉀、鈉、鎂和鈣以及3，6-脫水-D-半乳糖并聚物組成[1]。目前卡拉膠被大量應(yīng)用于食品行業(yè)，如葡萄酒[2]、飲料[3]、果凍[4]、酸奶[5]等，其主要起雜質(zhì)凝聚、增稠和凝固的作用。 卡拉膠可被降解為有較高活性的卡拉膠寡糖，成為卡拉膠寡糖后， 分子鏈上的活性基團可以更大程度的暴露，因此相對于大分子聚合物的卡拉膠而言，有著更高的活性[6]，且卡拉膠寡糖結(jié)構(gòu)多樣，物化性質(zhì)復(fù)雜，并且有著抗氧化[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]和抗腫瘤[9]的性質(zhì)，因此其被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)[10-11]。 卡拉膠寡糖可通過物理降解[12]、化學(xué)降解[13]和酶降解[14]得到。 化學(xué)降解法和物理降解法反應(yīng)劇烈，且降解產(chǎn)物單一性差，反應(yīng)條件不易控制，排放廢物污染環(huán)境，因此應(yīng)用方面受到了諸多的限制。 相比之下由于酶具有專一性強、穩(wěn)定性強、反應(yīng)溫和等特點，并且微生物酶的活性相對較高，利用微生物產(chǎn)酶來降解卡拉膠得到卡拉膠寡糖能夠節(jié)約能源，有著更大的經(jīng)濟效益[15]。 越來越多的卡拉膠裂解酶對豐富卡拉膠寡糖的種類有著重要作用。

卡拉膠酶屬于水解酶類，可特異性地將卡拉膠分子的β-1，4 糖苷鍵切斷，在酶的作用下大分子卡拉膠糖苷鍵斷裂產(chǎn)生卡拉膠寡糖。 卡拉膠酶種類繁多， 其中κ-卡拉膠酶可專一性的使κ-卡拉膠結(jié)構(gòu)單元中連接4-硫酸基-半乳糖和3，6-內(nèi)醚-D-半乳糖的β-1，4 糖苷鍵斷裂[16-17]。 目前研究表明已從假單胞菌[18]、鏈霉菌[19]、弧菌[20]等屬的細菌中發(fā)現(xiàn)了多種κ-卡拉膠酶，且大部分酶已經(jīng)在大腸桿菌[21-22]和畢赤酵母[23]中實現(xiàn)了重組表達，但卡拉膠酶依舊是制約卡拉膠寡糖構(gòu)效關(guān)系的重要因素，也是卡拉膠寡糖研究乃至進一步應(yīng)用開發(fā)的主要瓶頸因素[24-25]。當前市場酶解制備寡糖已經(jīng)逐漸開始替代酸解法，因此其研究具有深遠的理論意義和應(yīng)用價值。 本研究中從遼寧省大連市海底泥中篩選得到一株高產(chǎn)卡拉膠裂解酶菌株， 經(jīng)16S rDNA 測序鑒定為紅球菌屬。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品 采自13 個遼寧省大連市不同坐標位置的海泥。

1.1.2 藥品與儀器 無機鹽母液：MgSO4·7H2O 5.0 g，F(xiàn)ePO4·4H2O 0.1 g，K2HPO4·12H2O 10.0 g，CaCl21.0 g，單蒸水1 000 mL。

富集培養(yǎng)基：κ-卡拉膠2.0 g，NaNO320.0 g，無機鹽母液100 mL，海水900 mL；pH 7.5。

κ-卡拉膠篩選培養(yǎng)基：κ-卡拉膠12.0 g，NaNO320.0 g，NaCl 15.0 g， 瓊脂15.0 g， 無機鹽母液100 mL，海水900 mL；pH 7.5。

固體種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，酵母膏20 g，蛋白胨20 g，NaCl 20 g，瓊脂粉20.0 g，自來水1 000 mL；pH 7.0。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，酵母膏20 g，蛋白胨20 g，NaCl 20 g，陳海水1 000 mL；pH 7.0。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：κ-卡拉膠2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g，蛋白胨3 g，陳海水1 000 mL；pH 值自然。

DNS 溶液（250 mL） ：1.625 g DNS 溶于少量蒸餾水中，溶解后移入250 mL 容量瓶中，加入2 mol/L NaOH 65 mL，再加入11.25 g 甘油，搖勻，待其冷卻后定容至250 mL。

BPC-150F 型培養(yǎng)箱： 上海茸研儀器有限公司產(chǎn)品；DK-600S 型電熱恒溫水浴鍋： 上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；ZWY-2102C 型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；全波長酶標儀：北京昊諾斯科技有限公司產(chǎn)品；顯微鏡：尼康儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；自動微生物鑒定分析系統(tǒng)：Biolog 公司產(chǎn)品；FP-1100-C 型Bioscreen C分析儀：Oy Growth Curves Ab Ltd 生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的富集與篩選 稱取混合后的海泥10 g，放入盛有90 mL 富集培養(yǎng)基和玻璃珠的三角瓶中，25 ℃、160 r/min 過夜振蕩培養(yǎng)，使樣品充分分散。再吸取10 mL 富集培養(yǎng)液于盛有90 mL 無菌水并有小玻璃珠的250 mL 三角瓶中， 振蕩15 min 使其搖勻。 梯度稀釋后每個梯度取100 μL 涂布于κ-卡拉膠篩選培養(yǎng)基平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取生長良好、在平板上產(chǎn)生透明圈或凹坑的形態(tài)不一的菌落進行多次劃線純化，得到單菌落。

將分離得到的菌株挑取一環(huán)， 接種于5 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)36 h 后，將其以1%的接種體積分數(shù)接于100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，25 ℃、160 r/min 條件下培養(yǎng)（3 組平行）。 連續(xù)每2 h 取發(fā)酵液離心（10 000 r/min、4 ℃、10 min）去除沉淀細胞，取上清液制成粗酶液，測定卡拉膠降解酶活力。

1.2.2 酶活力的測定 酶活力測定采用DNS（3，5-二硝基水楊酸）法，以質(zhì)量濃度為0.5 g/dL 的κ-卡拉膠（用50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4、pH 7.0 的緩沖液溶解）作為底物。

取50 μL 處理后的粗酶液（對照組1 的酶液以沸水浴5 min 后的50 μL 酶液代替）， 添加550 μL質(zhì)量濃度為0.5 g/dL 的κ-卡拉膠溶液，35 ℃水浴20 min，沸水浴5 min 后加入0.9 mL DNS 溶液并沸水浴5 min，冷卻至室溫后加蒸餾水至5 mL，混勻，于520 nm 下測定吸光度值，以滅活酶液為對照組。利用實驗組和對照組吸光度的差值計算還原糖的產(chǎn)生量。

1 個酶活力單位（U）定義為：在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μg 還原糖的酶的劑量。

1.2.3 菌株的鑒定 對酶活力高的菌株進行形態(tài)學(xué)鑒定（菌落形態(tài)觀察和革蘭氏染色）、生理生化鑒定（Biolog 自動微生物鑒定分析系統(tǒng)）和分子生物學(xué)鑒定（菌株的16S rDNA 序列測定由大連寶生物公司擴增、測序），并與NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫進行比對，利用MEGA5 進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.2.4 菌株生長曲線及產(chǎn)酶活性曲線的測定 挑取一環(huán)菌株于液體種子培養(yǎng)基中，160 r/min、25 ℃培養(yǎng)至OD600=0.5 后，以1%的接種體積分數(shù)接種于液體種子培養(yǎng)基中， 使用FP-1100-C 型Bioscreen C 分析儀（每孔300 μL，25 ℃震蕩培養(yǎng)，每2 h 檢測一次OD600，連續(xù)檢測3 d）檢測菌株生長情況，繪制菌株生長曲線。

挑取一環(huán)菌株接種于5 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，再以1%的接種體積分數(shù)接種100 mL 于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、160 r/min 條件下培養(yǎng)，每2 h 取樣測其酶活， 連續(xù)檢測3 d， 并設(shè)酶活最高時相對酶活為100%，繪制菌株產(chǎn)酶活性曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選

采用以κ-卡拉膠為唯一碳源的平板從海泥中分離出產(chǎn)卡拉膠酶的菌株，由于卡拉膠酶會使卡拉膠降解為還原糖，故會在平板上產(chǎn)生凹坑或水解透明圈。 接著再將初篩得到的菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用DNS 法檢測是否產(chǎn)生還原糖，再次確定其是否有卡拉膠酶活力，并篩選出酶活力最強的菌株進行下一步試驗。

通過初篩， 從13 個海泥樣品中獲得了4 株在培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈或凹坑的菌株，并將其分別標注為LG-1、LG-2、LG-3、LG-4（見圖1）。 將初篩得到的4 個菌株， 接種于卡拉膠發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，利用DNS 法測定每個菌株的酶活力，以每株菌最高產(chǎn)酶酶活作圖進行比較如圖2 所示，通過DNS 法測定酶活進行復(fù)篩，可見4 個菌株都具備卡拉膠酶活力，并且得到LG-2 號菌株酶活力最強為34 U/mL，對其進行下一步試驗。

圖1 篩選培養(yǎng)基菌落Fig. 1 Colony map of screening media

圖2 菌株產(chǎn)酶活性的篩選Fig. 2 Screening of enzyme activity in strains

2.2 LG-2 菌落及菌株形態(tài)觀察

LG-2 號菌在固體種子培養(yǎng)基和卡拉膠培養(yǎng)基上生長良好，單菌落近似圓形，邊緣整齊，中間隆起，呈金黃色，不透明，用接種環(huán)易于挑取，表面光滑，較濕潤。 經(jīng)革蘭氏染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察，其呈革蘭氏陽性，單個菌呈球狀，單個散生或多個聚集（見圖3）。

圖3 菌株LG-2 顯微形態(tài)（×1 000）Fig. 3 The micrograph of LG-2 strains

2.3 LG-2 號菌株生理生化鑒定

采用Biolog 自動微生物鑒定分析系統(tǒng)檢測該菌對碳源的利用嗜好和對化學(xué)物質(zhì)的敏感程度。 接入GenⅢ微孔板于33 ℃培養(yǎng)24 h， 使用Biolog Microstation 儀器進行讀數(shù)。 并根據(jù)最終獲得的表型同Biolog 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比較，以判斷微生物的種屬。

根據(jù)該菌對碳源的利用嗜好性和對化學(xué)物質(zhì)的敏感程度結(jié)果，Biolog 自動微生物鑒定分析系統(tǒng)的鑒定結(jié)果為Rhodococcus fasciansB 菌（帶化紅球菌），SIM 值 為0.516，PROB 值 為0.870，Organism Type 為GP-Rod（革蘭氏陽性桿菌），該結(jié)果與革蘭氏染色結(jié)果一致。

該菌對蔗糖、D-果糖、肌醇、L-蘋果酸、丙酸、乙酸、D-麥芽糖、明膠、檸檬酸、果膠等碳源利用較佳；化學(xué)物質(zhì)敏感性試驗結(jié)果表明該菌微弱耐受萘啶酮酸和氨曲南，對高鹽環(huán)境、低pH 值、醋竹桃霉素和利福霉素SV 等不耐受，見表1。

表1 菌株LG-2 生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical identification of strain LG-2

2.4 16S rDNA 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌落LG-2 經(jīng)16S rDNA 測序大小為1 440 bp，如圖4 所示，其PCR 產(chǎn)物電泳在1 000～2 000 bp 的條帶之間且更靠近1 000 bp 的條帶，與測序結(jié)果一致。將16S rDNA 測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫基因序列進行比較， 搜索得到同源性達到99%以上的菌株，均為紅球菌。 結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征和生理生化結(jié)果綜合比較，確定菌株LG-2 為紅球菌菌屬，利用MEGA5 構(gòu)建Rhodococcussp. LG-2 的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5 所示。 結(jié)合以往的報道，大多數(shù)產(chǎn)卡拉膠酶的菌屬多為假單胞菌和弧菌，很少有關(guān)于紅球菌屬產(chǎn)卡拉膠酶的報道，因此該菌可進行進一步的研究與開發(fā)。

圖4 LG-2 的16S rDNA 電泳圖Fig. 4 Electrophoresis pattern of 16S rDNA PCR product of strain LG-2

圖5 Rhodococcus sp.LG-2 的16S rDNA 的序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of Rhodococcus sp. LG-2

2.5 LG-2 號菌株生長曲線及產(chǎn)酶活性曲線

根據(jù)鑒定結(jié)果選擇合適培養(yǎng)基， 利用FP-1100-C 型Bioscreen C 分析儀測LG-2 菌株的生長曲線，并設(shè)酶活最高時的相對酶活為100%，繪制產(chǎn)酶活性曲線如圖6 所示。 可見該菌潛伏期較短，可迅速進入對數(shù)生長期，且對數(shù)生長期較長，在培養(yǎng)36 h 后該菌逐漸進入穩(wěn)定期，在培養(yǎng)54 h 后進入衰退期。 該菌隨著菌株生長進入對數(shù)生長期其產(chǎn)酶活性快速上升，在培養(yǎng)22 h 時有最大產(chǎn)酶活性，且穩(wěn)定性較好， 在培養(yǎng)20～28 h 內(nèi)仍可保持相對酶活在80%以上，在培養(yǎng)48 h 后酶活急劇下降，并且隨著菌株進入衰亡期產(chǎn)酶活性也降低至20%以下，該菌的特性有利于進行工業(yè)生產(chǎn)， 并且在培養(yǎng)20～26 h內(nèi)最適合進行酶的提取。

圖6 LG-2 菌株生長曲線與產(chǎn)酶活性曲線Fig. 6 Growth curve and enzyme production curve of LG-2 strain

3 結(jié) 語

本實驗中用唯一碳源法， 從13 種來自大連不同坐標地區(qū)的海泥樣品中分離產(chǎn)κ-卡拉膠酶的菌株，得到一株高產(chǎn)酶菌株LG-2，酶活為34 U/mL。后通過其形態(tài)學(xué)分析、 生理生化鑒定和16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育同源分析，初步鑒定LG-2 為紅球菌屬，革蘭氏陽性菌。 根據(jù)菌株生長曲線及產(chǎn)酶活性曲線進行分析，可知該菌在培養(yǎng)22 h 后即可達到最高產(chǎn)酶活性，有利于卡拉膠酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

本實驗中篩選出的菌株為紅球菌菌屬，其產(chǎn)卡拉膠酶的報道較少，該菌株酶活性相對較高，經(jīng)有效的重組表達后，可將其廣泛地應(yīng)用于卡拉寡糖的食品、藥物研發(fā)與工業(yè)生產(chǎn)中，降低生產(chǎn)成本。