過(guò)度煎炸油誘發(fā)大鼠肝臟損傷及其機(jī)理研究

張?jiān)：?王雨揚(yáng)， 商文婷， 周中凱

（天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津300457）

近年來(lái)，人們的生活水平逐年提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的改變，煎炸食品由于其獨(dú)特的口感和誘人的風(fēng)味特別受消費(fèi)者的青睞，與此同時(shí)人們對(duì)煎炸油的攝入量也急劇的增加[1-2]。 在加熱煎炸油的過(guò)程中，由于高溫、水分、空氣（氧氣）的存在，使油脂分子發(fā)生許多復(fù)雜的氧化、水解、聚合反應(yīng)。 在這些反應(yīng)過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量的有害物質(zhì)，這些有害物質(zhì)會(huì)對(duì)人類的健康產(chǎn)生不利的影響[3-4]。 這也是近些年“三高”人群逐漸增多的原因之一。 “三高”指高血壓、高血糖和高血脂，這些慢性疾病也會(huì)進(jìn)一步引發(fā)心血管疾病、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化以及代謝綜合征等，嚴(yán)重危害人類健康[5-6]。 除此之外，過(guò)度攝入煎炸食品， 除了油脂本身品質(zhì)降低危害健康外，一些焙烤、煎炸食品在加工生產(chǎn)過(guò)程中由于食物組分的多樣性、熱不穩(wěn)定性以及交互反應(yīng)等也極易產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，影響機(jī)體正常的必需脂肪酸的代謝，這也逐漸引起了人們的重視[7-8]。 因此，探討過(guò)度煎炸油在氧化變質(zhì)，尤其是高溫煎炸一些高淀粉和蛋白質(zhì)食物后油脂成分的變化對(duì)動(dòng)物機(jī)體的毒害作用，具有極其重要的意義。

肝臟是機(jī)體新陳代謝的主要器官，也是機(jī)體清除內(nèi)毒素和解毒的重要器官，同時(shí)還是一些毒性物質(zhì)首要攻擊的靶器官，而肝臟主要的解毒方式是增加化合物的水溶性，加速它們的排出[9-10]。 食用油脂在高溫煎炸后會(huì)產(chǎn)生大量對(duì)機(jī)體有害的物質(zhì)，例如一些多環(huán)芳烴以及一些氧化產(chǎn)物等[11-13]，大量攝入煎炸油無(wú)疑會(huì)大大加重肝臟解毒的負(fù)擔(dān)，造成毒性物質(zhì)的積累，損害肝細(xì)胞，破壞肝臟正常的生理功能。 作者通過(guò)分子生物學(xué)手段以健康大鼠為研究模型探討煎炸油對(duì)肝臟功能影響的機(jī)理，為人們以后的健康飲食提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF 級(jí)成年Wistar 大鼠24 只（生產(chǎn)許可證編號(hào)SCXK-（軍）2012-0004，購(gòu)自人民解放軍軍事科學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量290～310 g， 于天津科技大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心飼養(yǎng)。 飼養(yǎng)條件：溫度20～25 ℃，濕度50%～55%，正常采光；自由攝食進(jìn)水，飼喂基礎(chǔ)飼料。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并經(jīng)天津科技大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)管理中心認(rèn)可。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 福臨門一級(jí)大豆油：中糧食品營(yíng)銷有限公司產(chǎn)品。

MK-3 酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo 公司產(chǎn)品；Neofuge 13R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：Heal Force Development Ltd 產(chǎn)品； 梯度PCR 儀：Bio-Rad 公司產(chǎn)品；UV-可見分光光度計(jì)：美國(guó)Agilent 公司產(chǎn)品；BX51 顯微鏡：OLMPUS 公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；超低溫冰箱：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB）試劑盒：南京建成生物制劑有限公司生產(chǎn)；RNA 提取試劑盒、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、 一步熒光定量RT-PCR試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；PCR 引物：由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 24 只受試動(dòng)物在適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將其隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組（Con 組）、正常油脂組（NEO 組）、過(guò)度煎炸油組（DFEO 組）。各組動(dòng)物分別以生理鹽水、正常油脂和過(guò)度煎炸油灌胃，每組每只大鼠定量1.5 mL/d，各組動(dòng)物自由進(jìn)食基礎(chǔ)飼料，共干預(yù)6 周。

1.2.2 飼養(yǎng)條件 飼養(yǎng)條件以分籠飼養(yǎng)， 每籠4只，自然晝夜，節(jié)律光照。 基礎(chǔ)飼料成分見表1。

表1 動(dòng)物飼料成分表Table 1 Ingredient list of animal feed

1.2.3 過(guò)度煎炸油的制備 為模擬多次煎炸過(guò)程中油脂主要成分的變化，研究一些淀粉、蛋白質(zhì)類食物煎炸后產(chǎn)生的毒性物質(zhì)對(duì)機(jī)體的影響， 參照KULIGOWSKI 等[14]制備煎炸油脂的方法并作改進(jìn)。具體做法為：將原樣大豆油加熱（控制在190 ℃左右）后，間歇性煎炸薯?xiàng)l、雞排、魚丸、雞翅、薯片、饅頭片等，每天煎炸5～6 h，如此重復(fù)約1 周，制備過(guò)度煎炸油。 處理完畢后，冷卻，防止其在空氣中氧化，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 各種指標(biāo)的測(cè)試方法 相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)：大鼠干預(yù)6 周后，禁食不禁水12 h 后，將大鼠放入乙醚麻醉盒中直至其角膜反射和痛覺反射消失，腹部主動(dòng)脈取血，同時(shí)取肝臟組織后處死。 全血靜置2～3 h，在高速冷凍離心機(jī)中離心（3 500 r/min，4 ℃，15 min）， 用移液器吸取上層血清分裝到eppendorf管中，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。 采用試劑盒法測(cè)定動(dòng)物血清中各指標(biāo)的含量，每組8 個(gè)樣品，3 組共計(jì)24 個(gè)樣品。 指標(biāo)測(cè)試嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求，每個(gè)樣品重測(cè)3 次，取平均值。

基因的mRNA 表達(dá)量： 采用總RNA 提取試劑盒提取大鼠肝臟組織總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作， 之后將1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 用于后續(xù)的實(shí)時(shí)定量PCR 測(cè)定。 以18S 基因?yàn)閮?nèi)參基因，每次從3 個(gè)試驗(yàn)組中取1 個(gè)樣本做試驗(yàn)，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3 次。 RT-PCR 條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)后，72 ℃10 min 保證完全延伸。處理數(shù)據(jù)得到mRNA 的相對(duì)表達(dá)量[15]。選取的內(nèi)參基因及目的基因的引物序列見表2。

表2 用于擴(kuò)增mRNA 的實(shí)時(shí)定量PCR 的引物序列表Table 2 List of primers used to amplify mRNA by quantitative real-time PCR

1.2.5 肝組織病理學(xué)觀察及肝臟指數(shù)的計(jì)算

式中，I為肝臟指數(shù)；m1為肝臟質(zhì)量，g；m0為小鼠體質(zhì)量，g。

處死大鼠后，速取肝臟并稱質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)。于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取右前葉肝組織約2 g，用體積分?jǐn)?shù)4%中性甲醛溶液固定， 做石蠟切片，H& E 染色，鏡下觀察肝臟組織病理變化，判斷肝損傷情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，試驗(yàn)結(jié)果以±S表示，各組間采用One-way ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)水平

體質(zhì)量等各項(xiàng)生理指標(biāo)相同的大鼠在連續(xù)干預(yù)6 周后發(fā)生明顯變化，其中補(bǔ)充正常食用油干預(yù)的老鼠的體質(zhì)量明顯高于對(duì)照組（見表3）?？梢?，過(guò)多的攝入正常油脂會(huì)使自身脂代謝增加，進(jìn)而有誘發(fā)肥胖的可能。 有報(bào)道指出我國(guó)人均油脂的攝入量已達(dá)到44 g，已超過(guò)世界衛(wèi)生組織規(guī)定的30%。 與此相一致的是肥胖和超重的人數(shù)也在逐年增加[16]。DFEO 組體質(zhì)量最低， 煎炸油脂的毒性已影響到機(jī)體正常的合成代謝，該組大鼠無(wú)法維持正常的生命活動(dòng)。 周雅琳[17]用煎炸油連續(xù)喂養(yǎng)大鼠30 d 后發(fā)現(xiàn)，和喂食新鮮油的大鼠相比，雌鼠和雄鼠的體質(zhì)量都明顯降低。 這個(gè)結(jié)果與我們的結(jié)果也是一致的。 肝臟指數(shù)是評(píng)價(jià)肝臟病變的重要指標(biāo)，其高、低水平可從側(cè)面反映肝臟的機(jī)能情況。 由以上數(shù)據(jù)看出，DFEO 組肝臟指數(shù)也發(fā)生明顯變化，其肝臟指數(shù)2.61 顯著低于對(duì)照組的2.91（P＜0.05），推測(cè)其原因可能是長(zhǎng)時(shí)間干預(yù)后， 一些毒性物質(zhì)在肝臟中積累，毒害甚至殺死了部分肝細(xì)胞。

表3 大鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)Table 3 Body weight and liver index in rats

2.2 各組大鼠肝臟相關(guān)酶活力的變化

臨床了解肝功能主要是通過(guò)檢測(cè)血清中ALT、AST、ALP、TBIL 等的水平。 ALT 在肝細(xì)胞液中含量較高，AST 在線粒體中含量較高[18]。正常細(xì)胞由于細(xì)胞膜的包裹，所以ALT 和AST 不會(huì)釋入血液中。 肝細(xì)胞受到損害后，細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞膜破碎或細(xì)胞膜的通透性增加， 肝細(xì)胞中所含的ALT 和AST就會(huì)被釋放到血液中， 使血液中ALT、AST 水平增加， 因此ALT 和AST 是檢驗(yàn)肝損傷靈敏而特異的指標(biāo)[19-20]。 同時(shí)ALP、TBIL、ALB 的含量也是肝功能檢測(cè)常用的指標(biāo)。 檢測(cè)血清中的ALT、AST、 ALP、TBIL 和ALB 水平，可反映肝組織受損或病變情況[21]。表4 顯示，在持續(xù)干預(yù)6 周后，DFEO 組大鼠血清中ALT、AST 水平均比對(duì)照組極其顯著升高（P＜0.01）；NEO 組大鼠血清中ALT 水平略有升高。 過(guò)度煎炸油已對(duì)大鼠肝臟造成嚴(yán)重?fù)p傷， 肝細(xì)胞壞損，ALT、AST 大量流出，同時(shí)ALP 水平也顯著升高（P＜0.05）。然而，TBIL 和ALB 在正常油脂和煎炸油干預(yù)后無(wú)顯著變化。

表4 各組大鼠肝功能指標(biāo)水平Table 4 Liver function indexes of rats in each group

2.3 各組大鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)變化

在正常生理狀態(tài)下，肝臟組織H & E 染色切片圖顯示肝細(xì)胞排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞形狀規(guī)則，細(xì)胞分界清晰，排列致密且均一，無(wú)細(xì)胞變性和異常，如圖1（a）所示。 圖1（b）顯示灌胃6 周正常油脂后，肝組織切片顯示有輕微變化，出現(xiàn)少量脂肪空泡。 然而，食用煎炸油干預(yù)6 周的大鼠則發(fā)生明顯的病變，正常組織結(jié)構(gòu)明顯消失，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝臟正常的放射狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，出現(xiàn)大量紅染顆粒，肝竇擴(kuò)張，該組多只大鼠出現(xiàn)明顯的脂肪大泡、彌漫性炎癥浸潤(rùn)（見圖1（c）），從組織形態(tài)病理學(xué)來(lái)看，過(guò)度煎炸油對(duì)肝組織的損傷十分明顯。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)觀察（H & E，×40）Fig. 1 Pathology of liver in different groups

2.4 不同油脂對(duì)大鼠肝臟組織中相關(guān)mRNA 表達(dá)的影響

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）是人體Ⅱ相代謝中至關(guān)重要的酶，它能催化谷胱甘肽與內(nèi)源性和外源性的親電子物質(zhì)結(jié)合。 該酶主要存在于肝臟內(nèi)，微量存在于腎、小腸、睪丸、卵巢等組織中。 由于肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)富含GST，當(dāng)肝細(xì)胞損害時(shí)，酶迅速釋放入血液，導(dǎo)致血清GST 活性升高。 GST 的亞家族在人體和大鼠中主要為Gsta、Gstp、Gstm[22]。 圖2 中DFEO組Gsta2和Gsta3基因的表達(dá)量均明顯下調(diào)（P＜0.01），下調(diào)幅度接近60%。 可見，過(guò)度煎炸油中的毒性物質(zhì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)在肝臟積累，毒害殺死肝細(xì)胞的同時(shí)，也在很大程度上影響相關(guān)基因的表達(dá)，使肝臟解毒能力下降。Gclc和Gclm都是谷氨酸半胱氨酸連接酶，也被稱為γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，是谷胱甘肽合成的第一個(gè)限速酶， 其基因Gclc和Gclm在DFEO 組大鼠中也明顯下調(diào)。 由此可見，攝入過(guò)度煎炸油后， 在很大程度上影響大鼠肝組織中Gsta2、Gsta3、Gclc、Gclm基因的表達(dá)量，破壞了肝臟正常的合成和代謝反應(yīng)，進(jìn)而影響機(jī)體正常的生命活動(dòng)[23-25]。

圖2 不同試驗(yàn)組mRNA 的相對(duì)表達(dá)量Fig. 2 Relative expression of mRNA in different groups

3 結(jié) 語(yǔ)

正常油脂在過(guò)度煎炸一些常見食物后會(huì)產(chǎn)生一些很強(qiáng)的毒性物質(zhì)，攝入動(dòng)物體后對(duì)肝組織造成很強(qiáng)的損傷， 長(zhǎng)期食用會(huì)破壞甚至殺死肝細(xì)胞，影響肝臟中一些重要基因的表達(dá)，嚴(yán)重危害肝臟正常的生理機(jī)能。 在日常生活中應(yīng)該少吃甚至遠(yuǎn)離煎炸食物，同時(shí)控制正常油脂的攝入量，少吃高油脂食物，倡導(dǎo)綠色健康飲食。