Fe3O4-COOH 納米材料對(duì)大腸桿菌菌株水平的指紋峰確定

黃艷玲， 程 楊， 李春媛

（1. 天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，天津300350；2. 天津市食品研究所有限公司，天津301609；3. 國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津） 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

利用MALDI-TOF MS 對(duì)微生物進(jìn)行鑒別已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)， 其中數(shù)據(jù)庫鑒別法是MALDITOF MS 微生物鑒別的最常用的方法。 數(shù)據(jù)庫鑒別法就是利用微生物建立標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)庫，將未知菌的質(zhì)譜譜圖與之比對(duì)， 通過指紋峰的比對(duì)，且超過一定閾值，從而確定微生物的歸屬[1-7]。

在數(shù)據(jù)庫鑒別法中，微生物的指紋峰或蛋白標(biāo)志物的確定非常重要， 通常由于質(zhì)譜條件限制，一般MALDI-TOF MS 對(duì)微生物鑒別只能達(dá)到屬和種的水平[8-9]。 利用數(shù)據(jù)庫鑒別法對(duì)于菌株水平的微生物鑒別目前還不成熟，主要是其表型與基因型非常相似，導(dǎo)致質(zhì)譜譜圖幾乎一致，很難找到足夠多的指紋峰對(duì)微生物進(jìn)行鑒別。 因此，發(fā)現(xiàn)更多的微生物指紋峰是目前利用MALDI-TOF MS 對(duì)微生物鑒別工作的一大挑戰(zhàn)[10-13]。

為了解決這一問題， 作者利用Fe3O4-COOH 納米材料對(duì)微生物裂解液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行富集，以提高M(jìn)ALDI-TOF MS 對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)的靈敏性與分辨率，通過增加質(zhì)譜中蛋白質(zhì)檢出的數(shù)量，以提高微生物指紋峰的數(shù)量，從而增加微生物鑒別效果[14]。作者通過Fe3O4-COOH 納米材料對(duì)大腸桿菌K-12 和大腸桿菌O127：H6 裂解液中蛋白質(zhì)的富集，達(dá)到對(duì)其進(jìn)行鑒別的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器

本文中所涉及的實(shí)驗(yàn)儀器主要用于對(duì)大腸桿菌的破壁與蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢測(cè)（見表1），其中恒溫水浴搖床對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，超聲波細(xì)胞破碎儀用于對(duì)大腸桿菌進(jìn)行細(xì)胞裂解得到細(xì)菌裂解液，而MALDI-TOF MS 則用于完成對(duì)細(xì)菌裂解液中蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

表1 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備Table 1 Experiment apparatus and equipments

1.2 材料

本實(shí)驗(yàn)中用于MALDI-TOF MS 分析的材料均為色譜純（見表2）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大腸桿菌的培養(yǎng) 利用TSB 細(xì)菌培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，培養(yǎng)16 h 后，取1 mL 發(fā)酵液10 000 r/min 離心6 min，用超純水清洗3 次后，依次10 倍稀釋，并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.3.2 大腸桿菌超聲裂解 用離心管取5 mL 大腸桿菌稀釋液，其中含有體積分?jǐn)?shù)0.1%的TFA，在冰浴下，超聲裂解3 min，細(xì)胞超聲裂解儀開3 s 關(guān)3 s。

1.3.3 菌體蛋白富集與MALDI-TOF MS 檢測(cè) 把合成完畢的Fe3O4-COOH 納米材料溶解于20 mmol/L的醋酸鈉溶液中， 最后定容Fe3O4-COOH 懸濁液至質(zhì)量濃度為10 mg/mL。 取100 μL Fe3O4-COOH 懸濁液加入到E. coli裂解液中， 振蕩30 min 充分吸附后， 磁性分離， 再用10 μL 磷酸緩沖液與10 μL乙腈洗脫10 min， 吸取1 μL 洗脫液與1 μL CHCA用于MALDI-TOF MS 分析。

MALDI-TOF MS 線性陽離子模式參數(shù)：離子源1：20 kV； 離子源2：17.8 kV；lens：6.00 kV；pulsed ion extraction：200 ns；matrix suppression：1 500；質(zhì)譜范圍m/z2 000～20 000 amu。

1.3.4 細(xì)菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索 大腸桿菌的MALDI-TOF MS 質(zhì)譜峰利用Tagident 蛋白質(zhì)分析軟件，檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，以確定各個(gè)質(zhì)譜峰的蛋白質(zhì)歸屬。

表2 試驗(yàn)藥品Table 2 Experimental reagents

2 結(jié)果與討論

2.1 富集前E. coil 菌株水平的鑒別

培養(yǎng)完畢的大腸桿菌，經(jīng)過1∶10 梯度稀釋得到細(xì)菌濃度為3×105CFU/mL 細(xì)胞懸濁液， 再利用細(xì)胞破碎儀對(duì)菌懸液進(jìn)行破壁，得到大腸桿菌的細(xì)胞裂解液，然后分成2 份，一份為對(duì)照，另一份進(jìn)行富集，加入100 μL Fe3O4-COOH 懸濁液到大腸桿菌裂解液中，震蕩30 min 充分吸附后，磁性分離，然后用10 μL 磷酸緩沖液與10 μL 乙腈洗脫，吸取1 μL 洗脫液與1 μL CHCA 用于MALDI-TOF MS 分析。

圖1 為Fe3O4-COOH 納米顆粒富集前2 個(gè)大腸桿菌菌株 （K-12 和DSM 30083T）MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖， 可以看出， 在m/z2 000～12 000 的質(zhì)譜范圍， 其質(zhì)譜圖在峰形上基本一致， 這主要是因?yàn)?個(gè)同屬同種大腸桿菌在表型上基本一致，而且大多數(shù)峰位置也基本相同，但相對(duì)峰的強(qiáng)弱不同，唯一不同的質(zhì)譜峰為大腸桿菌K-12 的m/z3 831（在圖1（a）用星號(hào)標(biāo)注的質(zhì)譜峰），因此，未富集的細(xì)胞裂解液直接用MALDI-TOF MS 分析，很難獲得更多的指紋峰用于細(xì)菌菌株水平的鑒別。

圖1 富集前大腸桿菌不同菌株的鑒別Fig. 1 Identification of different strains of Escherichia coli before enrichment

2.2 富集后E. coil 菌株水平的鑒別

圖2 為Fe3O4-COOH 納米顆粒富集大腸桿菌K-12 和大腸桿菌DSM 30083T 裂解液的MALDITOF MS 質(zhì)譜圖。 可以看出，經(jīng)過富集，質(zhì)譜圖的峰形有很大的改變，這主要是因?yàn)楹芏嗟拓S度的蛋白質(zhì)經(jīng)過富集后，可以被MALDI-TOF MS 檢測(cè)，而且質(zhì)譜圖的信噪比也大大提高。 富集前，質(zhì)譜圖信噪比大于3 的質(zhì)譜峰共28 個(gè)， 其可能的指紋峰僅僅只有1 個(gè)（見圖1）；富集后，MALDI-TOF MS 檢測(cè)的分辨率和靈敏性大大增加， 質(zhì)譜峰的數(shù)量達(dá)到110個(gè)左右， 其中大腸桿菌K-12 有16 個(gè)可能的指紋峰， 而大腸桿菌DSM 30083T 有21 個(gè)可能的指紋峰，文獻(xiàn)上用MALDI-TOF MS 常規(guī)方法對(duì)大腸桿菌不同菌株進(jìn)行檢測(cè)，其可能的指紋峰最多能達(dá)到14個(gè)。 因此， 通過使用Fe3O4-COOH 納米顆粒可以使MALDI-TOF MS 檢測(cè)獲得更多可能的指紋峰。

圖2 富集后大腸桿菌不同菌株的鑒別Fig. 2 Identification of different strains of Escherichia coli after enrichment

為了驗(yàn)證MALDI-TOF MS 檢測(cè)到的可能的指紋峰為大腸桿菌的蛋白質(zhì)質(zhì)譜信號(hào)， 檢索UniProtKB/Swiss-Prot 和UniProtKB/TrEMBL 的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫， 獲得匹配的質(zhì)譜信號(hào)的蛋白質(zhì)歸屬，其檢索結(jié)果列在表3， 其中大腸桿菌K-12 有4 個(gè)匹配的指紋峰，這些指紋峰沒有出現(xiàn)在大腸桿菌DSM 30083T 的譜圖上， 而大腸桿菌DSM 30083T 獲得9個(gè)指紋峰， 這些指紋峰沒有出現(xiàn)在大腸桿菌K-12的質(zhì)譜圖上，這些質(zhì)譜峰通過局部放大，標(biāo)注在圖3上，因此，通過以上實(shí)驗(yàn)表明，通過Fe3O4-COOH 納米顆粒對(duì)大腸桿菌細(xì)胞裂解液的富集，不僅可以增加MALDI-TOF MS 檢測(cè)的分辨率和靈敏性，而且可以大大增加大腸桿菌菌株水平的指紋峰數(shù)量。

3 結(jié) 語

作者利用Fe3O4-COOH 納米顆粒對(duì)大腸桿菌K-12 和大腸桿菌DSM 30083T 裂解液中的菌體蛋白進(jìn)行富集，不僅可以增加MALDI-TOF MS 檢測(cè)的分辨率和靈敏性，而且可以大大增加大腸桿菌菌株水平的指紋峰數(shù)量，從而提高M(jìn)ALDI-TOF MS 對(duì)大腸桿菌菌株水平的鑒別。 因此Fe3O4-COOH 納米顆粒富集菌體蛋白的方法有可能推廣應(yīng)用于致病菌菌株水平鑒別。

表3 大腸桿菌K-12 和DSM 30083T 蛋白標(biāo)志物數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果Table 3 Database search results of Escherichia coli K-12 and DSM 30083T protein markers

圖3 利用Fe3O4-COOH 納米顆粒富集的大腸桿菌K-12 和DSM 30083T 蛋白生物標(biāo)志物MALDI 局部質(zhì)譜圖Fig. 3 Partial mass spectra of Escherichia coli K-12 and DSM 30083T protein biomarkers enriched by Fe3O4-COOH particles