朱砂安神丸拮抗大鼠條件性恐懼及其睡眠障礙的作用

楊越趙航陳建寧李廷利

（黑龍江中醫(yī)藥大學中藥藥理教研室，黑龍江 哈爾濱150040）

恐懼是生物的一種基本感情，與生物的進化密切相關(guān)，它對人類的生存起到重要的作用，能夠激發(fā)一系列的機體防御機制［1］。 研究表明，海馬［2］、杏仁核復合體、外側(cè)隔核、丘腦部分亞區(qū)［3］、導水管周圍灰質(zhì)［4］等皮層下結(jié)構(gòu)及高級皮層前扣帶回等為主要參與核團。

睡眠障礙與恐懼情緒之間往往是相互伴生。 條件性恐懼動物實驗模型作為經(jīng)典的恐懼情緒研究模型，源于巴甫洛夫經(jīng)典條件反射，廣泛應用于對恐懼的習得、表達、消退和復原的研究以及學習和記憶的神經(jīng)機制研究。

朱砂安神丸首載于李杲的《內(nèi)外傷辨惑論·卷中·飲食勞倦論》，由當歸、甘草、黃連、地黃及朱砂組成［5］。 近年來研究表明，朱砂安神丸具有改善睡眠及治療多種精神疾病的作用。 王瑩等［6］的實驗表明，朱砂安神丸可以促進恐懼的記憶消退。 還有促進恐懼記憶消退、保護海馬神經(jīng)元、增強海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)與功能的可塑性［7］。 但朱砂安神丸對條件性恐懼導致睡眠障礙的治療研究較少。

本實驗通過條件性恐懼習得、消退過程中實驗動物的僵直時間和對恐懼習得和消退過程大鼠皮層腦電的描記，探究朱砂安神丸對條件性恐懼大鼠條件性恐懼習得和消退及在此過程中的覺醒-睡眠時間的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，SPF 級，黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（黑）2018-003。

1.1.2 儀器與試劑條件性恐懼實驗監(jiān)測系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XC404-2）；條件性恐懼實驗分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司，型號：SuperFcs）；大鼠獨立通氣籠IVC（蘇杭科技器材有限公司，型號：RU25H5）；朱砂安神丸（吉林省鑫輝藥業(yè)有限公司，批號：20170701）

1.2 方法

1.2.1 朱砂安神丸的制備根據(jù)藥品使用說明書得知成人服用最大劑量為9 g，根據(jù)體表面積折算法計算出大鼠的灌胃劑量0.81 g／kg，依據(jù)藥物濃度及實驗動物可服用劑量，確定給藥量為0.9 mL／100 g。朱砂安神丸供試液配制方法：精密稱取朱砂安神丸9.00 g，放置于研缽中，加入1%羧甲基纖維素鈉（CMC）至朱砂安神丸懸浮，轉(zhuǎn)移定容至100 mL 容量瓶中。

1.2.2 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼習得記憶的影響選取雄性SD 大鼠30 只，適應環(huán)境1 周后，隨機分成空白組、模型組、給藥組，每組10 只。 實驗組實驗動物灌胃給予朱砂安神丸7 d，空白組和模型組給予等量的1%CMC。 7 d 內(nèi)每日灌胃1 次，給藥時間在7：00—7：40 之間。 第7 日灌胃結(jié)束后，參照唐霜等［7］文章方法進行條件性恐懼模型的復制和條件性恐懼記憶習得測試，除空白組外各組實驗動物均進行足底電刺激。

1.2.3 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼記憶消退的影響選取雄性SD 大鼠30 只，適應環(huán)境1 周后，隨機分成空白組、模型組及給藥組，每組10 只。 實驗組灌胃給予朱砂安神丸7 d，空白組和模型組給予等量的1%的CMC。 模型復制的第2 天開始進行給藥處理，連續(xù)6 d，每天灌胃1 次，給藥時間為7：00—7：20 之間。 第2 天起，參照唐霜等［7］文章方法進行實驗動物的恐懼記憶消退，恐懼記憶的消退在連續(xù)的6 d 內(nèi)進行，每天1 次，消退時間在8：00—9：00之間進行。

1.2.4 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼習得過程覺醒-睡眠時間及睡眠時相的影響選取雄性SD 大鼠30 只，適應環(huán)境1 周后，隨機分成空白組、模型組及給藥組，每組10 只。 將各組實驗動物進行皮層腦電及肌電電極埋置手術(shù)，術(shù)后將各組實驗動物單籠飼養(yǎng)4 d。 之后進行藥物干預處理，給藥的第1 ～7 天對各組實驗動物進行灌胃處理，給藥時間在7：00—7：30。 在第7 天給藥結(jié)束后進行條件性恐懼模型復制。 模型復制結(jié)束后將各組實驗動物連接至16 道生理記錄儀中，連續(xù)記錄24 h。

利用Sleep Sign 軟件進行數(shù)據(jù)分析，以每10 秒為1 幀，根據(jù)大鼠EEG 及EMG，以每4 小時為1 個單位對大鼠睡眠-覺醒進行分析。

根據(jù)大鼠EEG 及EMG 波形，將大鼠的睡眠-覺醒周期分為3 個階段：

非快動眼（NREM）期：EMG 明顯減弱，振幅較?。籈EG 以紡錘波和低頻高幅波形為主，大鼠行為表現(xiàn)為閉目，全身靜臥不動，或埋頭蜷身熟睡。 快動眼（REMS）期：EEG 表現(xiàn)為低幅高頻信號的θ 波，EMG 消失。 覺醒（Wake）期：大鼠活動明顯，EMG 波動較為劇烈，EEG 則以不規(guī)則的高頻低幅信號為主。

1.2.5 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼記憶消退過程中覺醒-睡眠時間及睡眠時相的影響選取雄性SD 大鼠30 只，適應環(huán)境1 周后，隨機分成空白組、模型組及給藥組，每組10 只。 將各組實驗動物進行皮層腦電及肌電電極埋置手術(shù)，術(shù)后將各組實驗動物單籠飼養(yǎng)4 d。 之后將實驗動物置于條件性恐懼刺激箱中，進行條件性恐懼模型復制。 模型復制的第2～7 天對各組實驗動物進行灌胃給藥，時間在7：00—7：30。 每天灌胃結(jié)束后，于8：00—11：00 將各組實驗動物依次放入條件性恐懼刺激箱中進行條件性恐懼消退。 每天消退結(jié)束后將大鼠連接至16道生理記錄儀中，連續(xù)描記皮層腦電12 h。

利用Sleep Sign 軟件進行數(shù)據(jù)分析，以每10 秒為1 幀，根據(jù)大鼠EEG 及EMG，以每4 小時為1 個單位對大鼠睡眠-覺醒進行分析。

1.2.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼記憶習得的影響

實驗結(jié)果表明：與空白組相比，模型組條件性恐懼習得過程中，第1～5 個周期內(nèi)僵直反應時間明顯增加（P＜0.01），給藥組與模型組在第1～5 個周期內(nèi)的僵直反應時間無差異。 見圖1。

圖1 條件性恐懼習得過程中各組大鼠僵直反應時間Figure 1 Stiff reaction time of rats in each group during conditional fear acquisition

2.2 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼記憶消退的影響

實驗結(jié)果表明：在條件性恐懼消退階段，各組實驗動物僵直反應時間隨消退時間增加而逐漸減少；與空白組相比，模型組在第2 ～4 天僵直反應時間增加（P＜0.01）；第5 天模型組的僵直反應時間增加（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組在第4、5 天的僵直反應時間減少（P＜0.05）。 見圖2。

圖2 條件性恐懼記憶消退階段各組大鼠的僵直反應時間Figure 2 Stiff reaction time of rats in each group in the phase of conditional fear memory fading

2.3 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼習得過程覺醒-睡

眠時間及睡眠時相的影響

2.3.1 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼習得過程中Wake 時間及百分比的影響

實驗結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第1 ～3個周期，Wake 時間均有延長（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組在第1、2 個周期Wake 時間縮短（P＜0.05）。 與空白組相比，模型組在第1、2 個周期內(nèi)，Wake 期百分率提高（P＜0.05）；在第3 個周期內(nèi)，Wake 時間百分比增加（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組在第1～3 個周期Wake 時間百分比降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 條件性恐懼習得過程中各組大鼠Wake 時間及百分比Figure 3 Wake time and percentage of rats in each group during conditional fear acquisition

2.3.2 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼習得過程中睡眠總時間及百分比的影響

實驗結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第1 ～3個周期內(nèi)，睡眠總時間縮短（P＜0.01 或P＜0.05）；與模型組相比，給藥組第1 ～3 個周期內(nèi)的睡眠時間明顯高于模型組（P＜0.01）；與空白組相比，模型組在第1～3 個周期內(nèi)，睡眠時間百分比縮短（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組相比較，給藥組第1～3 個周期內(nèi)的睡眠時間百分比高于模型組（P＜0.05）。 見圖4。

2.3.3 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼習得過程中REMS 時間及百分比的影響

實驗結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第1 ～3個周期內(nèi)，REMS 時間減少（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組在第2 個周期內(nèi)，REM 時間明顯增加（P＜0.01）；第1 個周期和第3 個周期內(nèi)REM 時間增加（P＜0.05）；3 組實驗動物REMS 時間百分比無明顯變化。 見圖5。

2.3.4 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼習得過程中NREM 時間及百分比的影響

實驗結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第1 ～3個周期內(nèi)，NREM 時間減少（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，給藥組在第1～3 個周期內(nèi)，NREM 時間差異無統(tǒng)計學意義；3 組實驗動物NREM 時間百分比無明顯變化。 見圖6。

圖4 條件性恐懼習得過程中各組大鼠睡眠總時間及百分比Figure 4 Total sleep time and percentage of rats in each group during conditional fear acquisition

圖5 條件性恐懼習得過程中各組大鼠REMS 時間及百分比Figure 5 REMs time and percentage of rats in each groupduring conditioned fear acquisition

圖6 條件性恐懼習得過程中各組大鼠NREM 時間及百分比Figure 6 NREM time and percentage of rats in each group during conditioned fear acquisition

2.4 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼消退過程中覺醒-睡眠時間及睡眠時相的影響

2.4.1 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼記憶消退過程中Wake 時間及百分比的影響

實驗結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第2 ～4天，Wake 時間增加（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組實驗動物在第4、5 天Wake 時間明顯減少（P＜0.05）；與空白組相比，模型組在第2 ～4 天，Wake 時間百分比增加（P＜0.01）；在第5 天Wake 時間百分比增加（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組實驗動物在條件性恐懼消退第4、5 天Wake 時間百分比明顯減少（P＜0.05）。 見圖7。

2.4.2 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼記憶消退過程中睡眠時間及百分比的影響

實驗結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第2 ～4天，睡眠時間減少（P＜0.01）；第5 天睡眠時間減少（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組在第4、5 天睡眠時間增加（P＜0.05）。 與空白組相比，模型組在第2 ～4 天，睡眠總時間百分比降低（P＜0.01）；第5 天模型組睡眠時間百分比降低（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組實驗動物在第4、5 天睡眠時間百分比增加（P＜0.05）。見圖8。

圖7 條件性恐懼記憶消退過程中各組大鼠Wake 時間及百分比Figure 7 Wake time and percentage of rats in each group in the process of conditioned fear memory fading

圖8 條件性恐懼記憶消退過程中各組大鼠睡眠時間及百分比Figure 8 Sleep time and percentage of rats in each group in the process of conditioned fear memory fading

2.4.3 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼記憶消退過程中REMS 時間百分比的影響

實驗結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第2～5天，REMS 時間均有減少（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組實驗動物在第4 天REM 時間增加（P＜0.05）。見圖9。 3 組實驗動物REMS 時間百分比無明顯變化。

2.4.4 朱砂安神丸對大鼠條件性恐懼記憶消退過程中NREM 時間及百分比的影響

實驗結(jié)果表明：與空白組相比，模型組在第2～4天，NREM 時間明顯減少（P＜0.01）；第5 天，NREM時間減少（P＜0.05）；與模型組相比，給藥組在第4天，NREM 時間明顯增加（P＜0.01），第5 天NREM時間增加（P＜0.05）。 見圖10。 3 組實驗動物NREM時間百分比無明顯變化。

圖9 條件性恐懼記憶消退過程中各組大鼠REMS 時間及百分比Figure 9 REMs time and percentage of rats in each group in the process of conditioned fear memory fading

圖10 條件性恐懼記憶消退過程中各組大鼠NREM 時間及百分比Figure 10 NREM time and percentage of rats in each group in the process of conditioned fear memory fading

3 討論

恐懼是人們面臨威脅性情境時的一種情緒反應，在恐懼條件反射和恐懼消除測試的早期階段最明顯，杏仁核儲存恐懼記憶，并對厭惡經(jīng)歷期間儲存于其他腦域的情感記憶進行調(diào)節(jié)。 即杏仁核神經(jīng)元儲存恐懼記憶并易化儲存在其他腦域的恐懼記憶［8］。

條件性恐懼模型作為研究恐懼學習記憶的經(jīng)典實驗模型。 實驗動物將中性刺激CS 出現(xiàn)后接著匹配厭惡性刺激US，多次訓練后CS 轉(zhuǎn)變?yōu)闂l件刺激，進而引發(fā)行為和生理上的反應。 睡眠障礙與恐懼情緒之間往往是相互伴生，創(chuàng)傷性事件造成的恐懼情緒會引發(fā)睡眠障礙，而睡眠障礙又會對恐懼情緒的習得和表達產(chǎn)生影響。 當恐懼情緒產(chǎn)生時，往往伴隨著失眠或噩夢等。 因此可以推斷，恐懼與睡眠障礙的神經(jīng)生物學機制可能會有共同點。

有研究表明，外側(cè)杏仁核內(nèi)的去甲腎上腺系統(tǒng)參與了恐懼記憶的習得及鞏固過程，通過阻斷杏仁核內(nèi)的β 受體可以破壞恐懼記憶的習得及鞏固［9-10］。 研究表明，條件性恐懼可造成大鼠睡眠障礙，原因可能是條件性恐懼能夠增強LC-NA 的活動，進而投射至杏仁核的NA 神經(jīng)纖維直接激活杏仁核［11］。 LC-NA 神經(jīng)不僅參與恐懼的消退，也參與恐懼的表達，過高的LC-NA 功能抑制前額葉皮質(zhì)功能，減弱了消退過程中前額葉皮質(zhì)對杏仁核的抑制，表現(xiàn)為恐懼表達增強［12］。

本實驗研究表明，給藥組表現(xiàn)為隨消退時間增加，僵直時間逐漸減少，可能原因為朱砂安神丸可抑制LC-NA 神經(jīng)功能，一方面可能通過抑制NA 神經(jīng)的功能進而降低了NA 對前額葉皮質(zhì)（PFC）的抑制作用［13］；另一方面恢復海馬內(nèi)受損的神經(jīng)元，促進消退記憶寫入前額葉皮質(zhì)［14］，增強前額葉皮質(zhì)對杏仁核的控制作用，減少了恐懼的表達；朱砂安神丸能提升恐懼習得后的睡眠時長，縮短睡眠障礙恢復時間，其原因可能是朱砂安神丸能抑制下丘腦室旁核（PVN），降低LC-NA 神經(jīng)元的興奮性，使睡眠障礙逐漸恢復。

綜上所述，條件性恐懼能夠引起覺醒時間延長，睡眠時間縮短而對REM 及NREM 的睡眠比例無影響；朱砂安神丸能夠促進條件性恐懼消退；朱砂安神丸能夠拮抗由條件性恐懼引起的睡眠障礙。 關(guān)于朱砂安神丸拮抗條件性恐懼引起的睡眠障礙的具體機制仍需要進一步研究。