2 種雷美替胺雜質的制備與結構確證

鐘雅妮王征朱柏任熊淵

（珠海聯邦制藥股份有限公司，廣東 中山528467）

雷美替胺（Ramelteon）化學名為N-〔2-［（8S）-1，6，7，8-四氫-2H-茚并［5，4-b］呋喃-8-基］乙基〕丙酰胺，是日本武田公司（TAKEDA）開發(fā)的用于治療難以入睡失眠癥和慢性失眠、短期失眠的藥物，分別于2005 年和2008 年在美國和日本上市［1］。 該藥品為褪黑素受體激動劑，能模擬由松果體分泌的褪黑素的生理作用，有助于調節(jié)睡眠周期，改善睡眠質量。 雷美替胺對褪黑素受體的親和力較強，對氨基丁酸受體、阿片受體等無親和力，因此不會產生藥物依賴性；對慢性失眠癥、慢性原發(fā)性失眠癥的老年患者療效確切，且無后遺效應，不良反應與安慰劑相似［2-3］。

隨著人們對用藥安全要求的不斷提高，對藥品質量的要求也在不斷地提升，特別是針對藥品原料中的雜質需要進一步地明確和控制，因此，對藥品原料中雜質的研究成了當前研究的熱點和重點。 據文獻報道，（S）-N-［2-（6-氧代-1，6，7，8-四氫-2H-茚并［5，4-b］呋喃-8-基）-乙基］-丙酰胺（雜質Ⅰ，見圖1）是雷美替胺在生物體內的代謝產物［4］，而在實際研究中發(fā)現該化合物也是一種降解產物，在雷美替胺產品的制備或儲存中同樣會產生。 武田公司一項專利報道了在雷美替胺的制備過程中會產生（S）-N-［2-（7，8-二氫-6H-茚并［5，4-b］呋喃-8-基）-乙基］-丙酰胺（雜質Ⅱ，見圖1）［5］。 目前，尚未有雜質Ⅰ和雜質Ⅱ的制備分離方法的報道和對照物的銷售，本文對雜質Ⅰ和雜質Ⅱ的制備分離方法進行了研究，并進行了結構確證。

圖1 雜質Ⅰ和雜質Ⅱ的結構式Figure 1 Structure formula of impurityⅠand impurityⅡ

1 實驗部分

1.1 試藥與儀器

雷美替胺（珠海聯邦制藥股份有限公司，20 g）；乙腈（天津康科德科技有限公司，色譜級）；二氯甲烷（廣東光華科技股份有限公司，分析級）。

NP2000 型制備色譜儀（漢邦科技）；6470 型質譜（ESI 源，美國Agilent 公司）；AV400 型核磁共振（CDCl3為溶劑，德國Bruker 公司）。

1.2 方法

將雷美替胺置160 ℃高溫中破壞2 h，使用適量50%（體積分數，下同）乙腈水溶液對破壞后樣品進行溶解，作為制備溶液。 分次注入制備色譜儀，進行第1 次制備［色譜條件：色譜柱為kromasil C18（10 μm，21.2 mm×250 mm），檢測波長為225 nm，流速為30 mL／min，流動相為乙腈-水（體積比45 ∶55）］，分別收集相對保留時間為0.5 和1.5 處的峰相對應的洗脫液，所得2 組洗脫液分別置于50 ℃水浴中減壓旋蒸將流動相中乙腈蒸出，所得水相分別用100 mL 二氯甲烷萃取2 次，再將二氯甲烷蒸干，得到油狀物，然后進行第2 次制備。

1.2.1 （S）-N-［2-（6-氧代-1，6，7，8-四氫-2H-茚并［5，4-b］呋喃-8-基）-乙基］-丙酰胺（雜質Ⅰ）的制備

將第1 次制備所得油狀物（相對保留時間為0.5對應的洗脫液）用50%乙腈水溶液溶解，注入制備色譜儀，進行第2 次制備［色譜條件：色譜柱為kromasil C18（10 μm，21.2 mm×250 mm），檢測波長為225 nm，流速為30 mL／min，流動相為乙腈-水（體積比45 ∶55）］，收集主峰對應的洗脫液，置于50 ℃水浴中減壓旋蒸，將乙腈蒸出，所得水相用二氯甲烷100 mL 萃取2 次，再將二氯甲烷蒸干，所得產物用體積分數90%乙腈水溶液溶解，置于室溫下放置12 h重結晶，過濾后得到類白色固體。 經測定色譜純度為98.2%（約250 mg）。

雜質Ⅰ采用LC-MS 和核磁共振波譜法（1HNMR、13C-NMR）進行結構確證。 MS（ESI）：274.2［M＋H］＋；1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：1.12 ～1.15（t，3H），1.63 ～1.73（m，1H），1.91（s，2H，H2O），2.15 ～2.24（q，2H；m，1H），2.39 ～2.44（q，1H），2.83 ～2.90（q，1H），3.17 ～3.24（m，1H），3.25 ～3.30（q，2H），3.32～3.42（m，2H），4.64 ～4.71（q，1H），4.72 ～4.79（q，1H），5.74（s，1H），6.80 ～6.82（d，1H），7.57 ～7.59（d，1H）；13C-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：9.78，27.43，29.63，33.43，35.23，37.72，42.80，72.50，110.11，123.17，125. 17，130. 37，154. 83，166. 49，174.01，203.64。 雜質Ⅰ的MS 圖、1H-NMR 圖、13CNMR 圖見圖2。

1.2.2 （S）-N-［2-（7，8-二氫-6H-茚并［5，4-b］呋喃-8-基）-乙基］-丙酰胺（雜質Ⅱ）的制備將第1 次制備所得油狀物（相對保留時間為1.5 對應的洗脫液）用50%乙腈水溶液溶解，注入制備色譜儀，進行第2次制備［色譜條件：色譜柱為YMC C18ODS-AQ（10 μm，10 mm×250 mm），檢測波長為225 nm，流速為10 mL／min，流動相為乙腈-水（體積比36 ∶64）］，注入色譜儀，收集主峰對應的洗脫液，置于50 ℃水浴中減壓旋蒸，將乙腈蒸出，所得水相用二氯甲烷100 mL 萃取2 次，再將二氯甲烷蒸干，所得產物用體積分數90%乙腈水溶液溶解，置于室溫下放置12 h 重結晶，過濾后得到白色晶體。 經測定色譜純度為98.7%（約150 mg）。

雜質Ⅱ采用LC-MS 和核磁共振波譜法（1HNMR、13C-NMR）進行結構確證。 MS（ESI）：258.1［M＋H］＋；1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：1.08 ～1.12（t，3H），1.72～1.181（m，1H），1.88 ～1.95（m，1H），2.10～2.16（q，2H），2.17 ～2.20（m，1H），2.34 ～2.43（m，1H），2.88～2.95（m，1H），3.00～3.08（m，1H），3.36 ～3.40（q，2H），3.42 ～3.49（m，1H），5.48（s，1H），6.76（d，1H），7.11 ～7.14（d，1H），7.30 ～7.32（d，1H），7.60（d，1H）；13C-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：9.80，29.69，31.34，31.76，34.56，38.05，42.47，104.63，109.56，120. 42，123. 56，137. 60，138. 63，145.06，154.72，173. 67。 雜 質Ⅱ的MS 圖、1H-NMR 圖、13C-NMR 圖見圖3。

圖2 雜質Ⅰ的MS、1H-NMR、13C-NMR 圖Figure 2 MS、1H-NMR and 13C-NMR of impurityⅠ

圖3 雜質Ⅱ的MS、1H-NMR、13C-NMR 圖Figure 3 MS、1H-NMR and 13C-NMR of impurityⅡ

2 結果與討論

從MS、1H-NMR 和13C-NMR 數據可見，分離純化得到的2 種雜質與（S）-N-［2-（6-氧代-1，6，7，8-四氫-2H-茚并［5，4-b］呋喃-8-基）-乙基］-丙酰胺（雜質Ⅰ）、（S）-N-［2-（7，8-二氫-6H-茚并［5，4-b］呋喃-8-基）-乙基］-丙酰胺（雜質Ⅱ）的結構相符，并具有較高的純度，可以作為雷美替胺質量研究的對照物。雜質Ⅰ為雷美替胺在生物體內的代謝產物和儲存中的降解雜質，而雜質Ⅱ在雷美替胺合成過程和儲存中均未檢出，推測該雜質在一般條件下較難產生，只有在劇烈的高溫（160 ℃）中產生，由于是高溫破壞產生的雜質，可以歸為一種降解雜質。

為了獲得較高的雜質收率，第一步的高溫破壞試驗比較關鍵，過低的溫度不易產生目標雜質，溫度太高原料樣品容易碳化，160 ℃破壞2 h 是筆者經過測試得到的較優(yōu)條件，重現性較高。 最后一步重結晶使用體積分數90%乙腈水體系作為溶劑，可以獲得較好的固體形態(tài)，曾嘗試過甲醇-水、丙酮-水體系均不能獲得固體形態(tài)，只能獲得油狀物。