MTHFR基因多態(tài)性及血漿Hcy水平在腦卒中診斷中的臨床應(yīng)用

鄧愛鳳，梁麗萍，張光輝

深圳恒生醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 510180

腦卒中是一種腦血管意外，又稱中風(fēng)，是由遺傳因素及環(huán)境因素等多種誘發(fā)因素所共同作用導(dǎo)致的一種永久性的腦功能障礙，臨床表現(xiàn)為腦部供血受阻，導(dǎo)致患者腦部動脈狹窄、閉塞、破裂，引發(fā)急性腦血壓循環(huán)異常，臨床上具有較高的發(fā)病率、病殘率及病死率[1-2]。根據(jù)相關(guān)臨床資料顯示，中國腦卒中患者病死率為58/10萬～142/10萬，是導(dǎo)致人類死亡的三大死因之一，嚴重影響人們的生命健康[3]。因此，對腦卒中病因的研究以及預(yù)防成為臨床治療研究的重點。根據(jù)臨床研究顯示，腦卒中的發(fā)病與高同型半胱氨酸 (Hcy) 血癥密切相關(guān)，是引發(fā)腦卒中的獨立性危險因素[4]。葉酸、維生素B12或維生素B6攝入量過少或代謝過程中酶或因子發(fā)生異常，易引發(fā)高Hcy 血癥。影響高Hcy 血癥的眾多因素中較為重要的代謝關(guān)鍵酶是N5、N10亞甲基四氫葉酸還原酶 (MTHFR) ，MTHFR 多基因多態(tài)性對酶的特異活性作用很大，當(dāng)MTHFR基因突變時，導(dǎo)致MTHFR酶活性降低，使Hcy濃度升高及DNA 低甲基化，從而導(dǎo)致輕度或中度高Hcy血癥，引發(fā)多種疾病[5-6]。本文回顧性分析腦卒中患者中血漿MTHFR基因多態(tài)性及HCY、葉酸、維生素B12水平的變化，并探討其對腦卒中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年6 月至2019 年6 月在深圳恒生醫(yī)院接受治療且符合腦卒中臨床診斷標準的患者300 例作為觀察組，其中缺血性腦卒中181例，出血性腦卒中119 例；另選擇同期體檢健康者300例作為對照組。納入標準：①腦卒中患者均符合中國急性缺血性腦卒中診治指南標準，并經(jīng)CT 或MRI 檢查確診；正常健康體檢者均符合無血緣關(guān)系且無其他腦梗死或腦血管疾病癥狀；②近期 (1個月內(nèi)) 無感染癥狀且未使用影響血漿Hcy水平的藥物，如甲氨蝶呤、葉酸以及B族維生素類代謝等；③無占位性病變者。排除標準：①合并冠心病、糖尿病等疾病者；②具有心源性腦栓塞、肝腎功能嚴重不全及惡性腫瘤等疾病者；③甲狀腺功能損傷、免疫性疾病或血液系統(tǒng)疾病者；④具有長時間貧血史或胃潰瘍病史者。兩組受檢者的一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05) ，具有可比性，見表1。

表1 兩組患者的基本資料比較[例 (%) ]

1.2 觀察指標 (1) 兩組受檢者的血漿Hcy水平、葉酸、維生素B12水平及收縮壓、舒張壓、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白 (LDL) 、高密度脂蛋白 (HDL) 等指標； (2) 兩組受檢者的血漿MTHFR 基因多態(tài)性分型以及不同基因分型者的血漿Hcy水平； (3) 兩組受檢者血漿MTHFR基因型及等位基因頻率分布情況。

1.3 檢測方法

1.3.1 血漿Hcy、葉酸、維生素B12水平測定 循環(huán)酶法測定Hcy，取所有受檢者空腹靜脈血5 mL，采血須一次成功，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，抗凝處理10 min 后，采用2%乙二胺四乙酸二鈉100 μL 進行分離，4℃3 000 r/min 離心分離上層血漿，標本置于-70℃環(huán)境保存待測；檢測儀器采用日本Hitch 7080全自動生化分析儀，德國西門子公司提供的相關(guān)試劑盒，根據(jù)操作說明測定Hcy水平；采用德國西門子公司ADVIA Centaur XP 全自動免疫分析儀及相關(guān)試劑盒測定葉酸、維生素B12。血漿Hcy 濃度小于10 μmol/L時為正常值，10 μmol/L以上為高Hcy 血癥。

1.3.2 MTHFR 基因分型檢測 (1) 首先需提取DNA，取所有受試者靜脈血2 mL，經(jīng)EDTA抗凝處理，根據(jù)DNA 提取試劑操作說明方法完成提取和純化，樣本DNA 置于-20℃保存，凍融小于3 次； (2) 其次對純化后的DNA 標本進行PCR 擴增，適用0.2 mL 的擴增反應(yīng)管分裝MTHFR擴增液，擴增反應(yīng)體系共25 μL (19 μL 擴增液、1 μL 反應(yīng)液、5 μL DNA 模板) ，在94℃中預(yù)變10 min，進行95℃變性30 s、57℃退火45 s、72℃延伸45 s循環(huán)25次，在72℃延伸5 min時停止；擴增后置于2℃～8℃環(huán)境保存； (3) 最后進行雜交、顯色，取出擴增液產(chǎn)物10 μL 與雜交緩沖液進行混合，取抗體1支進行低速離心，對抗體進行稀釋，取出標記好的MTHFR基因芯片進行雜交，采用基因芯片圖像分析軟件進行掃描圖像，分析數(shù)據(jù)，觀察MTHFR 677 位點的等位基因，分別定義為C/C、C/T、T/T三種分型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的血漿Hcy水平等指標比較 觀察組患者的血漿Hcy水平明顯高于對照組，葉酸、維生素B12水平明顯低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) ；觀察組患者收縮壓明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) ，但舒張壓、總膽固醇、甘油三酯、LDL、HDL組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05) ，見表2。

表2 兩組受檢者的血漿Hcy水平等指標比較

表2 兩組受檢者的血漿Hcy水平等指標比較

注：1 mmHg=0.133 kPa。

組別例數(shù)觀察組對照組t值P值300 300 Hcy (μmol/L) 19.89±8.78 12.88±5.93 11.459 9＜0.05葉酸 (ng/mL) 5.62±1.34 7.32±3.53 7.798 4＜0.05維生素B12 (pg/mL) 347.82±125.32 476.43±122.65 12.703 6＜0.05收縮壓 (mmHg) 150.22±25.24 130.43±12.54 12.162 2＜0.05舒張壓 (mmHg) 85.62±13.44 84.43±15.43 1.007 3 0.314 2總膽固醇 (mmol/L) 6.47±2.36 6.72±1.13 1.654 9 0.098 5甘油三酯 (mmol/L) 1.62±0.24 1.59±0.64 0.760 2 0.4474 LDL (mmol/L) 4.42±2.55 4.32±2.63 0.472 8 0.636 5 HDL (mmol/L) 1.32±0.48 1.33±0.43 0.268 8 0.788 2

2.2 兩組受檢者的血漿MTHFR基因分布頻率比較 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律檢測觀察組MTHFR等位基因分布的頻率，其中C/C、C/T、T/T 實際頻數(shù)分別為90、129、81，預(yù)計頻數(shù)分別為89、131、80，數(shù)據(jù)均符合平衡定律 (χ2=3.347 8，P=0.067 5) ，表示均來自孟德爾群體。觀察組C/C基因型頻率及C等位基因頻率明顯低于對照組，T/T 基因型頻率及T 等位基因頻率明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) ；觀察組患者的C/T 基因型頻率略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05) ，見表3。

表3 兩組受檢者的血漿MTHFR基因分布頻率比較[例 (%) ]

2.3 兩組受檢者的不同基因分型血漿Hcy水平比較 兩組受檢者的T/T基因型血漿Hcy水平明顯高于C/C、C/T 基因型，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) ；觀察組患者的C/C、C/T、T/T基因型血漿Hcy水平明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) ，見表4。

表4 兩組受檢者的不同基因分型血漿Hcy水平比較，μmol/L)

表4 兩組受檢者的不同基因分型血漿Hcy水平比較，μmol/L)

注：與T/T基因型比較，aP＜0.05。

組別觀察組對照組t值P值例數(shù)300 300 C/C 14.89±4.78a 12.88±4.93a 5.069 9＜0.05 C/T 16.62±4.34a 13.32±3.53a 10.217 1＜0.05 T/T 26.82±7.32 24.43±5.65 4.476 8＜0.05

3 討論

腦卒中即腦血管疾病患者因遺傳因素、環(huán)境因素等多種因素誘發(fā)，導(dǎo)致患者腦血管出現(xiàn)供血不足、閉塞或破裂現(xiàn)象，腦功能嚴重損傷，且腦卒中病情發(fā)展迅速，發(fā)病率高且發(fā)病后具有較高的致死率[7]。因此，近些年有關(guān)腦卒中的預(yù)防和評估一直是臨床治療腦卒中研究的熱點。根據(jù)有關(guān)資料顯示，高HCY血癥是形成血栓的獨立危險因素，可能機制是HCY升高能夠造成內(nèi)皮細胞損傷，平滑肌細胞質(zhì)增殖，血小板活性增強，通過氧化應(yīng)激反應(yīng)，凝血激酶升高，抗凝血蛋白下降，從而促進腦卒中病情的產(chǎn)生和發(fā)展[8-9]。

本研究結(jié)果顯示，腦卒中患者與正常健康受試者的血壓狀況及總膽固醇、甘油三酯、LDL、HDL 差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而腦卒中患者的血漿Hcy 明顯較高，而葉酸、維生素B12水平明顯較低。研究結(jié)果證實了上述理論，這提示當(dāng)機體Hcy 水平升高時會導(dǎo)致生成氧自由基，血管內(nèi)皮細胞受損，從而使一氧化氮和前列環(huán)素合成降低，低密度脂蛋白氧化，血小板功能障礙，形成泡沫細胞，抑制腦血管動脈彈性，從而使血管阻力加大，增加腦血管血栓的風(fēng)險。同時，葉酸、維生素B12水平作為輔酶一旦缺乏也會導(dǎo)致Hcy水平升高，極易引起血管栓塞性事件的發(fā)生，這可能在于血漿Hcy 作為一種中間產(chǎn)物氨基酸，作用于人體甲硫氨酸循環(huán)中，主要通過再甲基化和轉(zhuǎn)硫兩種途徑完成代謝過程，完成代謝過程需要MTHFR、葉酸、輔酶維生素B12共同作用。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)MTHFR 基因多態(tài)性分布頻率，結(jié)果顯示腦卒中患者相較于正常健康者具有更高的T/T基因型頻率及T等位基因頻率，而C/C基因型頻率及C等位基因頻率顯著較低。這提示血漿Hcy代謝過程以5-甲基四氫葉酸作為甲基供體，能夠經(jīng)MTR 作用重新合成甲硫氨酸，其中葉酸是轉(zhuǎn)化5-甲基四氫葉酸的關(guān)鍵成分，MTHFR 能夠催化形成5、10-亞甲基四氫葉酸還原成N5-甲基四氫葉酸，因此MTHFR基因是Hcy 代謝中的關(guān)鍵酶。MTHFR 基因常見的酶缺陷是指MTHFR基因序列677 位點的點突變，發(fā)生由C 到T 的變化，導(dǎo)致丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，使MTHFR 酶活性降低約65%，與葉酸結(jié)合能力下降，增加血栓形成風(fēng)險[13-14]。一旦MTHFR出現(xiàn)含量不足或活性降低，引發(fā)Hcy代謝不足，體內(nèi)聚集，Hcy升高，引起高Hcy血癥，從而導(dǎo)致腦卒中風(fēng)險升高[15]。

根據(jù)臨床研究資料，C/C基因型的MTHFR酶的活性最高，C/T 基因型的活性中等，活性約為正常的65%，T/T基因型活性最低，活性約為正常的30%[18-19]。本研究結(jié)果證實了上述理論，根據(jù)不同基因分型Hcy 水平結(jié)果顯示，T/T 基因型血漿Hcy 水平明顯高于C/C、C/T 基因型，同時腦卒中患者的三種分型的血漿Hcy 水平均高于正常健康者，這提示腦卒中MTHFR基因的活性下降，導(dǎo)致Hcy再甲基化作用過程中出現(xiàn)代謝障礙，Hcy 水平升高，從而增加腦卒中的風(fēng)險[20]。

綜上所述，血漿MTHFR基因多態(tài)性、Hcy 水平與腦卒中的發(fā)生具有一定的關(guān)系，臨床上檢測兩種指標可以有助于及時提供針對性的預(yù)防和個體化治療方案。