東鄉(xiāng)野生稻稻曲病人工接種技術(shù)研究

胡建坤,黃 蓉,李湘民,劉永鋒,廖泰珍,黃瑞榮*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,江西 南昌 330200;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,江蘇 南京 210014;3.江西省寧都縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,江西 寧都 342800)

東鄉(xiāng)野生稻(OryzarufipogonGriff.)具有宿根(多年生),再生力和繁殖(無性)力強(qiáng),耐旱、耐貧瘠及多種抗逆性等有利性狀，它還含胞質(zhì)不育基因、廣親和基因、恢復(fù)基因、抗病蟲基因等多種有利基因[1-2]。其中,其耐冷基因在水稻育種上最先取得了實(shí)際應(yīng)用,已選育出在南昌自然條件下越年生粳稻品種(品系)4913-1[3-4]。姜文正等[5]指出東鄉(xiāng)野生稻9個群落的抗病性各不相同,多數(shù)群落對黃矮病免疫,抗白葉枯病、稻瘟?。话霐?shù)以上群落對白葉枯病、細(xì)條病表現(xiàn)多抗。黃瑞榮等[6-7]對東鄉(xiāng)野生稻在較多材料來源的基礎(chǔ)上進(jìn)行抗病性鑒定,發(fā)現(xiàn)東鄉(xiāng)野生稻感稻瘟病,但對白葉枯病和細(xì)條病抗性好,同時發(fā)現(xiàn)有5份材料對以上3種病害均表現(xiàn)抗性,為理想的抗源材料。然而,東鄉(xiāng)野生稻對稻曲病的抗性情況尚不清楚。

高效、準(zhǔn)確的人工接種技術(shù)可以減少抗性鑒定工作中客觀條件的影響和限制,增加鑒定工作的可靠性,加快鑒定工作的進(jìn)行。對于常規(guī)栽培水稻,張君成等[8]、王疏等[9]、林瑜凡等[10]在接種體、接種方法、接種濃度、接種水稻生育時期等多方面做過深入而全面的研究,形成了比較成熟可靠的人工接種技術(shù)。但東鄉(xiāng)野生稻與常規(guī)栽培稻在生物學(xué)性狀、生理生化及生長生育等方面存在著一定的差異,東鄉(xiāng)野生稻不同單株間也存在生物學(xué)性狀的不同,因此現(xiàn)有稻曲病人工接種技術(shù)是否在東鄉(xiāng)野生稻上適用尚不確定。本試驗(yàn)選擇3株東鄉(xiāng)野生稻單株作為接種材料,重點(diǎn)研究了水稻生長時期、接種體、接種時間、接種方法等4個因素對接種效果的影響,以期獲得成熟的東鄉(xiāng)野生稻人工接種技術(shù),為開展東鄉(xiāng)野生稻抗稻曲病的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試水稻的種植與管理

1.1.1 東鄉(xiāng)野生稻的種植與管理 由于東鄉(xiāng)野生稻不同單株間抽穗量及抽穗時間不同,因此為方便接種技術(shù)研究的開展,同時驗(yàn)證該技術(shù)在東鄉(xiāng)野生稻上的適用性,從107份東鄉(xiāng)野生稻單株中選擇3株抽穗較多、抽穗時間較為一致的單株DX13(A)、DX35(B)和DX67(C)進(jìn)行研究,每個單株種植10叢,分別編號為A1、A2,…,A10;B1、B2,…,B10;C1、C2,…,C10。東鄉(xiāng)野生稻單株在自然條件下按常規(guī)方法進(jìn)行管理,防治蟲害但不防治病害。

1.1.2 兩優(yōu)培九的種植與管理 以感病栽培水稻兩優(yōu)培九作為對照品種。兩優(yōu)培九于6月5日播種第一批,之后每隔7 d播種1批,共播種5批。移栽秧齡35 d,每批移栽10行,每行8叢,株行距21 cm×25 cm;設(shè)保護(hù)行和工作行。兩優(yōu)培九在自然條件下按常規(guī)方法進(jìn)行管理,防治蟲害但并不防治病害。

1.2 稻曲病菌菌株

供試強(qiáng)致病力稻曲病菌菌株UvB367由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所劉永鋒研究員提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 東鄉(xiāng)野生稻不同生長時期人工接種試驗(yàn) 采用注射接種方法,以菌絲片段-分生孢子混合液為接種體;選擇東鄉(xiāng)野生稻及兩優(yōu)培九生育期處于劍葉與倒二葉葉枕距為(2±0.5)、(4±0.5)、(6±0.5)cm的稻穗于當(dāng)日16:00～17:00進(jìn)行接種。

1.3.2 不同接種體人工接種試驗(yàn) 不同接種體的制備方法及其接種方法如下。

1.3.2.1 厚垣孢子 取上年使用UvB367接種后發(fā)病收集起來并在-20 ℃保存的稻曲球，放入馬鈴薯蔗糖液體(PS)培養(yǎng)基中,振蕩洗脫稻曲球表面的厚垣孢子,用紗布過濾掉雜質(zhì)及稻曲球；取濾液在血球計數(shù)板下計數(shù)并將厚垣孢子濃度稀釋至1×106個/mL，備用。

1.3.2.2 菌絲片段-分生孢子混合液 將5～6粒UvB367菌塊從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至100 mL PS培養(yǎng)基中,以135 r/min在28 ℃條件下震蕩培養(yǎng)6～7 d,將所有搖瓶中的培養(yǎng)液混合后用組織搗碎機(jī)粉碎,取少量在血球計數(shù)板下計數(shù)并將培養(yǎng)液稀釋至分生孢子濃度為1×106個/mL。將稀釋后的培養(yǎng)液充分混勻并平均分為3份,第1份即為菌絲片段-分生孢子混合液接種體。

1.3.2.3 分生孢子懸浮液 取1.3.2.2中獲得的第2份稀釋培養(yǎng)液用4層滅菌紗布過濾,用少量無菌水沖洗紗布后將濾液收集并以8000 r/min離心[8],去上清留沉淀,隨后用PS將沉淀重懸浮至分生孢子濃度為1×106個/mL,備用。

1.3.2.4 菌絲片段 取1.3.2.2中獲得的第3份稀釋培養(yǎng)液用4層滅菌紗布過濾,用少量無菌水沖洗紗布后用滅菌鑷子將紗布上所有菌絲挑至PS培養(yǎng)基中,將培養(yǎng)基定容至與第3份培養(yǎng)液過濾前相同的體積,備用。

采用注射接種法于16:00～17:00將上述不同接種體接種至東鄉(xiāng)野生稻及兩優(yōu)培九稻穗中。依據(jù)1.3.1中的試驗(yàn)結(jié)果,東鄉(xiāng)野生稻與兩優(yōu)培九分別選擇葉枕距為(4±0.5)cm及(6±0.5)cm的稻穗進(jìn)行接種。

1.3.3 當(dāng)日不同時間人工接種試驗(yàn) 采用菌絲片段-分生孢子混合液于當(dāng)日8:00～9:00、12:00～13:00和16:00～17:00分別進(jìn)行接種,接種方法及接種水稻的生長時期同1.3.2。

以上3個試驗(yàn)在東鄉(xiāng)野生稻A1～A9、B1～B9、C1～C9以及所有種植批次兩優(yōu)培九1～8行中滿足相應(yīng)條件的稻穗上進(jìn)行。由于東鄉(xiāng)野生稻滿足接種條件的稻穗較少,因此每個處理東鄉(xiāng)野生稻接種3～5個穗,對照品種兩優(yōu)培九接種10個穗。

1.3.4 不同接種方法的人工接種試驗(yàn) 分別研究醫(yī)用注射器注射接種和噴霧器噴霧接種對東鄉(xiāng)野生稻稻曲病的接種效果。

1.3.4.1 注射接種 用規(guī)格為5 mL的醫(yī)用注射器將孢子濃度為1×106個/mL的菌絲片段-分生孢子混合液從水稻穗中上部位注射入穗苞中,每穗注射2 mL,不超過2 mL的以菌液從穗苞頂端流出為準(zhǔn)；接種時間及接種水稻的生長時期同1.3.2。

1.3.4.2 噴霧接種 用SeeSa“SX-CS5F”型氣壓式噴霧器(工作壓力:3 hPa)將孢子濃度為1×106個/mL的菌絲片段-分生孢子懸浮液噴射到符合條件的稻穗上,噴射量以菌液在穗苞上聚成滴但又不滴下為準(zhǔn)；接種時間及接種水稻的生長時期同1.3.2。

注射接種在東鄉(xiāng)野生稻A1～A9、B1～B9、C1～C9以及不同批次兩優(yōu)培九1～8行中滿足相應(yīng)條件的稻穗上進(jìn)行,噴霧接種在東鄉(xiāng)野生稻A10、B10、C10以及不同批次兩優(yōu)培九第10行中滿足相應(yīng)條件的稻穗上進(jìn)行。

1.4 試驗(yàn)調(diào)查統(tǒng)計

于接種后10 d第一次調(diào)查接種水稻稻曲病的發(fā)病情況,之后每隔7 d調(diào)查一次,以水稻接近成熟時稻曲球不再增加為止。調(diào)查每個接種稻穗上稻曲球個數(shù),統(tǒng)計各處理稻曲球平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻生長時期對接種效果的影響

調(diào)查結(jié)果顯示,在東鄉(xiāng)野生稻DX13、DX35、DX67生長至劍葉與倒二葉葉枕距為(4±0.5)cm時接種,其稻曲球平均數(shù)明顯高于水稻劍葉與倒二葉葉枕距為(6±0.5)cm時接種;栽培稻兩優(yōu)培九在生長至劍葉與倒二葉葉枕距為(6±0.5)cm時接種,其稻曲球平均數(shù)明顯高于劍葉與倒二葉葉枕距為(4±0.5)cm時接種(表1)。結(jié)果表明,東鄉(xiāng)野生稻與兩優(yōu)培九的稻曲病接種最適時期并不一致(圖1)。東鄉(xiāng)野生稻DX13、DX35、DX67與栽培稻兩優(yōu)培九在葉枕距為(2±0.5)cm時接種均未誘發(fā)稻曲病,表明孕穗初期接種不利于誘發(fā)稻曲病(表1);試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此時接種還容易導(dǎo)致不抽穗或抽穗后稻?？諝がF(xiàn)象。

表1 水稻在不同生長時期接種后稻曲病的發(fā)病情況

圖1 在水稻不同生長時期接種后稻曲球平均數(shù)

2.2 接種體對接種效果的影響

調(diào)查結(jié)果(表2)顯示：以菌絲片段-分生孢子混合液為接種體接種東鄉(xiāng)野生稻DX13、DX35、DX67及兩優(yōu)培九時,誘發(fā)稻曲病的效果最好；以菌絲片段和分生孢子懸浮液為接種體接種時誘發(fā)效果次之；以厚垣孢子接種未能誘發(fā)東鄉(xiāng)野生稻及兩優(yōu)培九的稻曲病。結(jié)果表明,不同接種體接種對東鄉(xiāng)野生稻稻曲病的誘發(fā)效果不同,但對東鄉(xiāng)野生稻稻曲病的誘發(fā)效果趨勢與兩優(yōu)培九保持一致(圖2)。

表2 不同接種體接種后稻曲病的發(fā)生情況

2.3 接種時間對接種效果的影響

調(diào)查結(jié)果顯示,于8:00～9:00、12:00～13:00和16:00～17:00三個時間段對東鄉(xiāng)野生稻DX13、DX35、DX67及兩優(yōu)培九接種均可誘發(fā)稻曲病(表3),但病害嚴(yán)重度差異明顯,其中以16:00～17:00時接種的病情最為嚴(yán)重,其次為8:00～9:00時接種，而在12:00～13:00時接種的病情最輕(圖3)。結(jié)果表明,在一天中16:00～17:00接種最有利于東鄉(xiāng)野生稻稻曲病的發(fā)病,這與兩優(yōu)培九的最佳接種時間段是一致的。

接種體A:厚垣孢子;接種體B:分生孢子懸浮液;接種體C:菌絲片段;接種體D:菌絲片段-分生孢子混合液。

圖2 不同接種體接種后稻曲球平均數(shù)表3 一天中不同時間接種后稻曲病的發(fā)生情況

圖3 一天中不同時間接種后稻曲球平均數(shù)

2.4 接種方法對人工接種效果的影響

調(diào)查結(jié)果(表4)顯示：注射接種可誘發(fā)東鄉(xiāng)野生稻DX13、DX35、DX67及兩優(yōu)培九稻曲病的發(fā)生；噴霧接種未能誘發(fā)東鄉(xiāng)野生稻任何單株稻曲病的發(fā)生；噴霧接種可誘發(fā)兩優(yōu)培九稻曲病的發(fā)生,但病情嚴(yán)重度明顯低于注射接種的水稻(圖4)。該結(jié)果表明,注射接種更有利于誘發(fā)東鄉(xiāng)野生稻稻曲病的發(fā)生。

3 總結(jié)與討論

本研究采用不同接種體、不同接種方法,在水稻不同生長時期,于一天中不同時間對3株東鄉(xiāng)野生稻單株進(jìn)行稻曲病人工接種試驗(yàn),探索了東鄉(xiāng)野生稻稻曲病人工接種技術(shù)。結(jié)果表明,當(dāng)水稻生長至劍葉與倒二葉間距為(4±0.5)cm時,以菌絲片段-分生孢子混合液作為接種體,采用注射的方法于一天中16：00～17：00時進(jìn)行接種對東鄉(xiāng)野生稻誘發(fā)稻曲病效果最好。這一結(jié)果有助于指導(dǎo)東鄉(xiāng)野生稻的抗病性鑒定,篩選抗性群體及抗性個體,挖掘優(yōu)異野生抗性種質(zhì)。

表4 用不同方法接種后稻曲病的發(fā)生情況

圖4 用不同方法接種后稻曲球平均數(shù)

王疏等[9]、林瑜凡等[10]報道厚垣孢子可引起稻曲病的發(fā)生；王舒婷[11]則報道厚垣孢子未能引起稻曲病的發(fā)生。張君成等在2003年[12]報道了接種厚垣孢子的稻曲病發(fā)病率，但其病情指數(shù)均很低；2004年他卻又報道接種厚垣孢子沒有引起稻曲病的發(fā)病[8]。以上結(jié)果表明以厚垣孢子為接種體誘發(fā)水稻稻曲病的效果存在不穩(wěn)定性。在本研究中，厚垣孢子同樣沒有引起東鄉(xiāng)野生稻與兩優(yōu)培九的發(fā)病。相反,接種體菌絲片段-分生孢子對稻曲病有較好的誘發(fā)效果得到了較多學(xué)者[8,11,13-14]的認(rèn)可,本研究也得到了類似的結(jié)果。因此,在東鄉(xiāng)野生稻稻曲病人工接種中建議以菌絲片段-分生孢子混合液作為接種體。

張君成等[8]報道在水稻兩優(yōu)培九破口前6～9 d接種對稻曲病的誘發(fā)效果最好;代海霞等[13]報道水稻岡優(yōu)305在破口前4 d接種時的稻曲病發(fā)病效果好于在破口前7 d接種時的發(fā)病效果,表明不同水稻品種稻曲病誘發(fā)的最佳時期與破口期的間距不同。據(jù)楊秀娟等[14]報道，兩優(yōu)培九在孕穗期劍葉與倒二葉葉枕距為8～9 cm時接種誘發(fā)的稻曲球平均粒數(shù)高于在0～7 cm及10～13 cm時接種誘發(fā)的稻曲球平均粒數(shù),這與賈切[15]的研究結(jié)果“水稻粵優(yōu)938幼穗在劍葉與倒二葉葉枕距16～17 cm時接種誘發(fā)的稻曲病病穗率顯著高于在0～10 cm時接種誘發(fā)的稻曲病病穗率”不同,表明不同水稻品種處于稻曲病最佳誘發(fā)時期時劍葉與倒二葉葉枕距也不相同。本研究中東鄉(xiāng)野生稻與栽培稻兩優(yōu)培九處于稻曲病最佳誘發(fā)時期時劍葉與倒二葉葉枕距的不同也進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論。因此,在進(jìn)行多個水稻品種抗稻曲病人工鑒定時,以固定的稻穗破口前某一天或者統(tǒng)一的劍葉與倒二葉葉枕距進(jìn)行接種雖然接種條件一致,但反而會導(dǎo)致結(jié)果存在一定的誤差,建議對篩選出來的抗性材料在多個生長時期下接種以進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證,這樣得到的抗性鑒定結(jié)果會更加可靠。