TLR10基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎病毒感染的相關(guān)性研究

湯永志 王晨 陳華忠 朱敏 王奎鋒 朱堅(jiān)勝

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是我國慢性肝臟疾病患者發(fā)生肝硬化、肝癌的主要病因之一[1]。目前認(rèn)為HBV誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答是肝臟損傷和炎癥的主要機(jī)制。Toll樣受體2（toll like receptor 2，TLR2）與慢性HBV感染的關(guān)系密切，TLR2介導(dǎo)的信號通路能抑制HBV復(fù)制，也可成為HBV發(fā)生免疫逃避的作用靶點(diǎn)[2]。TLR10是一類無特異性配體的寡受體。相關(guān)研究表明，TLR10作為抑制性受體與TLR2形成異源二聚體，對TLR2下游白細(xì)胞介素1（IL-1）分泌進(jìn)行調(diào)節(jié)[3]。TLR10基因多態(tài)性是否參與慢性HBV感染過程中的免疫應(yīng)答，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究對TLR10啟動子區(qū)RS10004195（-113T/A）以及外顯子區(qū)RS11096957、RS4129009與HBV感染的關(guān)系作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取本院2012年9月至2015年12月收治的428例HBV感染患者為感染組，根據(jù)2010年《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行常規(guī)乙型肝炎標(biāo)志物檢測，并除外其他類型病毒感染、自身免疫性疾病、藥物、飲酒等引起的肝功能異常。選取同期在本院進(jìn)行體檢的210例健康者為對照組。感染組男280例，女148例；年齡（41.8±11.8）歲；肝臟炎癥程度（依據(jù) 2000年中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)會和肝病學(xué)會修訂的《病毒性肝炎防治方案》）：輕度172例，中度138例，重度24例，肝硬化94例；HBV DNA＜103IU/ml 60例，103～106IU/ml 134 例，＞106IU/ml 234 例；HBeAg（+）278例，HBeAg（-）150 例；有家族史 224 例，無家族史204例。對照組男134例，女76例；年齡（42.0±10.1）歲。兩組對象均為漢族人群，性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過，所有對象知情同意。

1.2 主要試劑和設(shè)備 全血基因組DNA提取試劑盒（1408G26，上海捷瑞生物工程有限公司），聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物：RS10004195（F：141008Q43/R：141008Q44）；RS11096957（F：141008Q45/R：141008Q46）上海捷瑞生物工程有限公司）。核酸定量分析儀（1702525，美國Biorad公司），小型高速離心機(jī)（5418，德國 Eppendorf公司），DNA測序儀（3730XL，美國 ABI公司）。

1.3 PCR及測序 采集患者晨間空腹外周血2～3ml，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na）抗凝后-80℃保存，以備DNA提取。（1）DNA抽提：按照全血基因組DNA抽提試劑盒說明書的步驟進(jìn)行，核酸定量分析儀檢測DNA濃度及A260/A280比值，比值為1.7～2.0的樣本作為PCR擴(kuò)增模板。（2）PCR 擴(kuò)增：RS10004195 上游引物 5′-CCTGGGTGACAAAGTGAGACCCTACCT-3′；下游引物5′-CTTAAACCCCATCCGCCCTCTT-3′；RS11096957 上游引物 5′-CTTAAACCCCATCCGCCCTCTT-3′；下游引物 5′-GTAGCCTGCCCATCTTAAACAC-3′。擴(kuò)增體系：10×緩沖液2.5μl，DNA模板0.5μl，MgCl21.0μl（25mmol/L），dNTP 0.5μl，TaqDNA 聚合酶 0.25μl，引物各 0.5μl，總體積為25μl，剩余體積用雙蒸水補(bǔ)足。PCR條件：RS10004195位點(diǎn)（95℃預(yù)變性 2min，94℃變性 45s，58℃退火90s，72℃延伸2min，共循環(huán) 35次）；RS11096957位點(diǎn)（95℃預(yù)變性 2min，94℃變性 45s，56℃退火 90s，72℃延伸2min，共循環(huán)35次），擴(kuò)增產(chǎn)物加入溴化乙錠染色的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像分析PCR產(chǎn)物特異性。（3）直接測序：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司，利用直接測序法進(jìn)行基因序列分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。對兩組人群RS10004195、RS11096957位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，以驗(yàn)證其群體代表性。計(jì)量資料用表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。兩組對象基因型及基因頻率[等位基因頻率=（2×純合子數(shù)+雜合子數(shù)）（/2×受檢人群）]用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，同時計(jì)算OR值及其95%CI。各位點(diǎn)基因型兩組間的關(guān)系比較采用logistic回歸分析，倍增P值經(jīng)Bonferroni校正（n=3）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組對象RS10004195與RS11096957基因型及等位基因分布特征比較 兩組對象RS10004195、RS11096957位點(diǎn)均符合 Hardy-Weinberg平衡（χ2=2.11、0.34和0.03、0.93，均P＞0.05），提示本研究人群具備群體代表性。在RS10004195位點(diǎn)，感染組基因型（AA+AT）變異頻率為76.64%，明顯高于對照組的63.81%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；等位基因A頻率為53.50%，高于對照組的39.05%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在RS11096957位點(diǎn)，感染組基因型（CA+AA）的變異頻率為75.70%，與對照組的69.52%比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；感染組等位基因A頻率為50.93%，高于對照組的43.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1～2。

2.2 HBV感染患者臨床特征與RS10004195基因變異的關(guān)系 在HBV感染患者中，HBeAg陽性患者RS10004195位點(diǎn)基因型（AA+AT）變異頻率較HBeAg陰性患者增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而在肝臟炎癥程度、HBV DNA水平、家族史等方面，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表1 兩組對象RS10004195與RS11096957基因型分布特征比較[例（%）]

表2 兩組對象RS10004195與RS11096957等位基因分布特征比較[例（%）]

2.3 兩組對象TLR10基因多態(tài)性的logistic回歸分析 校正年齡、性別等混雜因素后進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果顯示RS10004195在共顯性模型、顯性模型和隱性模型中的OR值及95%CI分別為2.862（1.572～5.211）、1.712（1.142～2.566）、2.487（1.541～4.014），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；提示T向A突變時，HBV感染風(fēng)險增高。RS11096957在共顯性模型、顯性模型和隱性模型中的OR值及 95%CI分別為1.028（0.651～1.623）、0.905（0.595～1.378）、1.254（0.787～2.000），差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；提示其與HBV感染無關(guān)。RS4129009在共顯性模型、顯性模型和隱性模型中的OR值分別為0.639（0.424～0.963）、0.540（0.375～0.780）、1.016（0.559～1.847），其中顯性模型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），共顯性模型、隱性模型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；提示存在A向G突變，HBV感染的風(fēng)險降低。

3 討論

TLR10基因單核苷酸多態(tài)性與人類多種疾?。ㄈ缜傲邢傺譡4]、幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎[5-6]、肥胖[7]和2型糖尿病[8]、結(jié)腸癌[9]、結(jié)核[10]、骨關(guān)節(jié)炎[11]、膀胱癌[12]、剛果出血熱[13]、支氣管哮喘[14]、鼻咽癌[15]、呼吸道合胞病毒感染[16]、IgA腎病[17]等）存在關(guān)聯(lián)。盡管尚未發(fā)現(xiàn)特異性配體，且TLR10參與人體疾病的確切機(jī)制也尚未明確，但近年來有關(guān)TLR10參與機(jī)體免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的研究結(jié)果提示其在人體免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。TLR10在人體B細(xì)胞和漿樣樹突狀細(xì)胞中表達(dá)，通過MyD88信號通路介導(dǎo)下游炎性因子分泌[18]，人調(diào)節(jié)T細(xì)胞可表達(dá)TLR10，且受FOXP3、NF-AT復(fù)合體的調(diào)控[19]。在人單核細(xì)胞系THP-1中，TLR10也有表達(dá)，缺氧或活性氧均能增強(qiáng)TLR10表達(dá)[20]?，F(xiàn)有研究認(rèn)為TLR10是一種功能性受體，人TLR10轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)TLR2配體pam3CSK4（Pam3Cys）刺激后，血清中IL-6、IL-8水平較野生基因型小鼠明顯降低，TLR10交聯(lián)后的外周血單個核細(xì)胞IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra）mRNA和蛋白高水平表達(dá)；在HEK293細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，阻斷TLR10后，配體刺激下的TLR2細(xì)胞通路下游炎性因子分泌增多，提示TLR10是TLR家族中唯一通過產(chǎn)生IL-1Ra參與TLR2信號通路應(yīng)答的抑制性受體，并發(fā)揮抗炎的特性[3]。在TLR10干預(yù)下，U397細(xì)胞中 TLR2/1配體（PAM3CSK4）、TLR2/6配體（MALP-2）、TLR3配體（pI:C）和 TLR4配體（LPS）介導(dǎo)的下游炎性因子IL-6、干擾素β表達(dá)均明顯下降，提示TLR10廣泛抑制了上述TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，進(jìn)一步研究顯示 TLR10通過抑制信號通路中 IκB、MAPK、MyD88和TRIF蛋白的表達(dá)，影響下游炎性因子分泌[21]。綜上所述，TLR10作為一種功能性受體在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，通過與其他TLR協(xié)同，在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

HBsAg通過阻斷JNK-MAPK通路選擇性抑制巨噬細(xì)胞TLR2下游IL-12分泌而逃避免疫攻擊[22]。在HBV感染過程中，HBeAg陽性患者的肝細(xì)胞、庫否細(xì)胞和單個核細(xì)胞TLR2表達(dá)低于HBeAg陰性患者，慢加急性肝衰竭患者T細(xì)胞TLR2表達(dá)明顯增加，通過促進(jìn)Th17細(xì)胞分化和外周血單個核細(xì)胞應(yīng)答參與疾病進(jìn)展[23-24]。在體外小鼠模型中，預(yù)激活的TLR2增強(qiáng)T細(xì)胞的應(yīng)答，加速了HBV清除，間接印證了TLR2在HBV感染中發(fā)揮病毒抑制或清除的作用[25]。以上結(jié)果提示TLR2與HBV感染關(guān)系密切，在HBV感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

表3 HBV感染患者臨床特征與RS10004195基因變異的關(guān)系[例（%）]

TLR10作為一種抑制性功能受體，參與TLR2信號通路介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)。筆者前期報道了RS4129009位點(diǎn)HBV DNA＞106IU/ml或HBeAg陽性的患者中基因型變異頻率較高（P＜0.05）[26]。本文初步探討了慢性HBV感染與TLR10基因多態(tài)性的關(guān)系，結(jié)果提示啟動子區(qū)RS10004195出現(xiàn)變異基因A時與HBV易感性強(qiáng)相關(guān)，校正性別、年齡等混雜因素后logistic回歸分析顯示，純合突變個體HBV易感風(fēng)險增高，且在HBeAg陽性患者突變的比例較高，提示慢性HBV感染與TLR10單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)有一定關(guān)聯(lián)。TLR10參與了TLR2信號通路應(yīng)答，并發(fā)揮抑制性效應(yīng)，在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。綜上，TLR10基因多態(tài)性與HBV感染存在關(guān)聯(lián)，但TLR10是否作為抑制性受體參與HBV感染過程中機(jī)體免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、幫助HBV逃避TLR2通路介導(dǎo)的免疫應(yīng)答尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。