漢防己甲素對卵蛋白誘導大鼠哮喘模型的抗氧化保護作用

林益平 吳美玲 魏艷麗 應曉倩 裘穎兒 潘曉明 丁明星 唐紅娟 翁美貞

哮喘是一種常見的由多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，具有可變氣道阻塞和支氣管高反應性。臨床上，哮喘患者會反復出現(xiàn)喘息、咳嗽、胸悶和呼吸急促等癥狀[1]。慢性炎癥一直是該疾病的研究熱點，而近年來，有研究發(fā)現(xiàn)治療頑固性哮喘的無效性與氧化應激有關，提示抗氧化在哮喘治療中具有重要意義[2]。核因子-E2相關因子（Nrf2）是一種氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，是氧化應激和環(huán)境應激反應的關鍵調(diào)節(jié)因子。Nrf2缺陷小鼠對哮喘的易感性增加，包括氧化應激、炎癥、黏液和氣道高反應性（AHR），Nrf2的特異性激活可以顯著降低過敏原誘導的氣道高反應性及炎癥反應，抑制輔助性T淋巴細胞2（Th2）類細胞因子分泌，降低氧化應激反應和減輕氣道滲漏，增強上皮屏障功能[3-4]。漢防己甲素（Tet）主要從防己科千金藤屬植物粉防己塊莖中提取，是一種鈣通道阻滯劑，臨床試驗發(fā)現(xiàn)它對硅沉著病、高血壓、炎癥和肺癌有效，且毒性較小。Tet的藥理作用主要表現(xiàn)在抗氧化、增強細胞自噬、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥和鈣通道修飾等方面[5-6]。Tet不良反應小，低濃度即具有較好的抗氧化作用，具有良好的應用前景，但相關機制研究非常少。本研究擬建立卵蛋白（OVA）誘導大鼠哮喘模型，探討Tet對哮喘的治療效果及抗氧化機制，為Tet的臨床應用提供更多理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物、試劑及儀器 30只雄性SD大鼠，體重（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。Tet購自浙江華潤三九眾益制藥有限公司；谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（A061-1，48T）和 γ-谷氨酰半胱氨全成酶（γ-GCS）試劑盒（A091-1，100管/48樣）均購自南京建成生物工程研究所；SYBR Green PCR試劑盒購自美國 Thermo Fisher Scientific公司（4309155，1×5ml）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國MBI Fermentas公司（K1621，10次）；大鼠半胱氨酰白三烯（CysLT1）ELISA kit購自美國R&D Systems公司（RDC0341，96T）；大鼠半胱氨酰白三烯受體（CysLTR1）ELISA kit購自武漢華美生物工程有限公司（CSB-EL006465RA，96T）；平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（ab32575，40μl）、Nfr2 抗體（ab137550，50μl）與山羊抗兔單克隆抗體（ab205718，500μg）均購自英國Abcam公司。光學顯微鏡（日本尼康公司，D5100）；酶標儀（美國Thermo Scientific公司，MULTISKAN MK3）；實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司，StepOne TM）。

1.2 模型建立及分組給藥 30只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和Tet治療組各10只。模型組和Tet治療組 1次/2d霧化吸入 1mg/ml OVA溶液30min，共8周。按照文獻[7]方法造模成功后，哮喘大鼠出現(xiàn)撓鼻，打噴嚏，喘息癥狀。Tet治療組用100mg/kg Tet灌胃處理，1次/d，共8周，對照組和模型組予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃處理，1次/d，共8周。實驗結(jié)束后用1%戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠，剖開各組大鼠胸腔，取出肺臟，用預冷的0.9%氯化鈉溶液清洗。用于病理檢測的肺臟樣本在4%多聚甲醛中保存，其他實驗所需的樣本在液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肺組織病理切片檢查 肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，用乙醇梯度脫水、包埋、切片至4μm，采用HE染色、脫水、中性樹膠封片。光學顯微鏡下拍照（200倍），觀察肺組織氣道壁和氣管周圍炎性細胞情況。

1.4 肺組織CysLT1和CysLTR1含量的檢測 采用ELISA法。稱取肺樣本（100mg）并在1ml含有蛋白酶抑制劑的組織蛋白提取試劑中勻漿，2 500r/min，低溫離心機（Eppendorf，5702R）離心 20min，獲得上清液。按照ELISA檢測試劑盒方法，在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl，溫育、洗滌、加酶，再次溫育和洗滌后顯色，加終止液終止反應，空白調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值），以OD值為縱坐標，標準品（即已知確切濃度的標準物品，作為含量測定中的標準含量）為橫坐標，得標準曲線，再將樣品OD值代入，從而測定肺組織CysLT1和CysLTR1含量。

1.5 肺組織氧化應激相關指標的測定 采用分光光度法。大鼠肺組織稱重剪碎，在0.1M Tris-HCl（pH7.4）緩沖液中制備勻漿液，2 500r/min，低溫離心10min，取上清液待測。按照γ-GCS、氧化型谷胱甘肽（GSSG）及GSH等試劑盒說明書，于酶標儀中分別測定每個指標含量。根據(jù)GSH和GSSG檢測結(jié)果，計算GSH/GSSG比值，比率下降情況反映脂質(zhì)過氧化損傷情況。

1.6 肺組織Nrf2、血紅素加氧酶-1（HO-1）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）的 mRNA表達水平測定 采用qRT-PCR法。取大鼠肺組織，剪碎加入1ml TrizolTM試劑提取肺組織RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA產(chǎn)物2μl，加入SYBR Green Mix 12μl、上游引物和下游引物（見表1）各0.5μl，并加入雙蒸水（ddH2O），體系總體積為 20μl，進行q-PCR擴增。反應程序：95℃ 5min，1個循環(huán)；95℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 30s，40 個循環(huán)；95℃ 15s，58℃ 15s，1 個循環(huán)。讀取各個擴增反應的Ct值，利用2-ΔΔCt法計算Nrf2、HO-1、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1 的 mRNA 表達水平。

表1 各qPCR引物序列

1.7 肺組織α-SMA和Nrf2蛋白表達情況檢測 采用免疫熒光染色法。將玻片在60°C的培養(yǎng)箱中干燥40min，二甲苯中脫蠟，乙醇梯度脫水。切片浸泡在0.3%檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐加熱。再用3%過氧化氫去離子水處理，加 α-SMA（1∶200）和 Nrf2（1∶100）一抗，4°C過夜。加二抗37°C孵育 30min，PBS清洗 2次，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復染。DAPI染色細胞核，覆蓋住樣品，室溫放置5～10min，0.9%氯化鈉溶液洗2～3次，每次3～5min，洗去DAPI。中性膠封片，用光學顯微鏡檢查。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肺組織病理檢查結(jié)果比較 對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，而模型組大鼠肺組織氣道壁增厚，并且氣管周圍可見炎細胞聚集；而Tet治療組較模型組肺組織氣道壁厚度減輕，并且炎細胞浸潤情況有所緩解，見圖 1（插頁）。

2.2 3組大鼠肺組織CysLT1和CysLTR1含量比較與對照組相比，模型組CysLT1和CysLTR1含量均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；而與模型組比較，Tet治療組肺組織CysLT1和CysLTR1含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表2。

表2 3組大鼠肺組織CysLT1與CysLTR1含量比較（mg/g）

2.3 3組大鼠肺組織氧化應激相關指標比較 與對照組相比，模型組肺組織γ-GCS活性明顯增加，GSH含量明顯下降，GSSG含量明顯增加，GSH/GSSG比值降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；與模型組相比，Tet治療組肺組織γ-GCS活性明顯降低，GSH含量明顯增加，GSSG含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表 3。

表3 3組大鼠肺組織氧化應激相關指標比較

2.4 3 組大鼠肺組織 Nrf2、HO-1、TGF-β1、MMP-9 和TIMP-1 mRNA表達水平比較 與對照組相比，模型組肺組織 Nrf2、HO-1、TGF-β1、MMP-9 表達水平均明顯增加，TIMP-1 mRNA表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；與模型組比較，Tet治療組肺組織Nrf2、HO-1、TIMP-1 mRNA 表達水平明顯增加，TGF-β1、MMP-9 mRNA表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.01），見表 4。

2.5 3組大鼠肺組織α-SMA和Nrf2免疫熒光染色結(jié)果比較 對照組大鼠肺組織α-SMA和Nrf2熒光呈現(xiàn)弱陽性，而模型組大鼠肺組織α-SMA和Nrf2的熒光呈強陽性表達；而Tet治療組較模型組肺組織α-SMA熒光強度有所減弱，Nrf2熒光強度增強，見圖2（插頁）。

3 討論

哮喘是一種常見的呼吸道慢性炎癥性疾病，影響著全世界數(shù)百萬人。幾十年來，一直使用支氣管擴張劑和皮質(zhì)類固醇治療哮喘，如吸入型糖皮質(zhì)激素，但對哮喘氣道重塑影響不大，且治療不良反應較大。因此，近年來研究員致力于開發(fā)新的治療藥物。有研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素受體激動劑對糖皮質(zhì)激素受體有選擇性作用，可顯著減少藥物不良反應[8]。一些單克隆抗體如Dupilumab阻斷白細胞介素4（IL-4）和IL-13的信號傳導，可作為青少年和成人中重度哮喘的輔助治療，取得較好的效果[9]，但價格昂貴。用我國傳統(tǒng)中藥哮喘防治是一個新的思路，具有較大潛力，也愈來愈被國家和科研工作者重視。如平喘寧湯通過磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶點（MTOR）信號通路抑制自噬現(xiàn)象而治療哮喘[10]，溫通湯促進嗜酸細胞凋亡從而治療哮喘[11]。Tet在中國藥典中被廣泛引用，可用于治療高血壓、哮喘、肺結(jié)核、痢疾和癌癥等疾病，但其在哮喘治療中的作用機制依舊不明。

表4 3組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1 mRNA表達水平比較

目前抗哮喘機制的研究重點是阻止氣道炎癥反應和緩解氣道重塑。本研究成功構(gòu)建了大鼠哮喘氣道重塑模型，各實驗組肺組織病理學變化結(jié)果顯示，Tet能抑制炎細胞浸潤，減輕氣道壁厚度，說明大鼠哮喘模型構(gòu)建成功，且Tet具有較好的治療作用。CysLTs是由5-脂氧合酶途徑形成的促炎介質(zhì)，可誘發(fā)支氣管收縮、微血管滲漏、黏液分泌和氣道炎癥細胞募集增多，與多種類型的哮喘有關[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組CysLT1和CysLTR1含量顯著增加，Tet治療顯著降低肺組織CysLT1和CysLTR1含量。α-SMA和TGF-β1均是氣道重塑的關鍵因子，參與血管和纖維生成，在慢性肺部疾病如哮喘中高表達[13-14]。MMPs可以分解細胞外基質(zhì)，其中MMP-9與氣道壁膠原沉積相關性最強，導致氣道重塑[15]。TIMPs是MMPs特異性抑制因子，能抑制氣道重塑。本研究顯示，模型組高表達α-SMA、TGF-β1、MMP-9，低表達 TIMP-1。Tet能抑制 α-SMA、TGF-β1、MMP-9表達，增加TIMP-1表達。上述結(jié)果提示Tet通過抑制哮喘大鼠氣道重塑和炎癥，顯示出良好的抗哮喘效果。

關于導致氣道炎癥和氣道重塑機制，近年來人們逐漸認識到氧化應激可能起到重要作用。氧化與抗氧化之間的不平衡會導致細胞損傷，被稱為氧化應激。肺部持續(xù)地暴露在各種不同類型和程度的氧化劑中，導致嗜酸性粒細胞和中性粒細胞積累而促進了哮喘的發(fā)生[16]。GSH是人類和其他哺乳動物含有的一種主要非蛋白硫醇，GSH及其相關酶既能防止氧化損傷，又能解毒，是肺內(nèi)最主要的抗氧化物質(zhì)。在氧化應激下，兩個GSH分子通過二硫化物橋連接形成GSSG[17]。因此，評估GSH/GSSG比值可以評估細胞氧化還原代謝情況。γ-GCS為合成GSH的限速酶。OVA誘導的小鼠體內(nèi)GSSG升高，GSH/GSSG比值下降，研究發(fā)現(xiàn)山茱萸能降低GSSG水平，升高GSH/GSSG比值[18]。補充硫化氫（H2S）或抑制一氧化氮合酶（iNOS）導致GSH/GSSG比值增加，保護氣道免受氧化應激，可治療炎癥性肺病[19]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組肺組織GSH含量下降，GSSG含量增加，GSH/GSSG比值顯著降低，而γ-GCS活性增加，可能是哮喘發(fā)作過程導致氧化劑增加，GSH被過度消耗，反饋性使γ-GCS合成增加所致。經(jīng)過Tet治療后，肺組織GSH含量增加，GSSG含量降低，GSH/GSSG比值顯著增加，隨之γ-GCS也反饋性合成減少，提示Tet是通過抗氧化作用而發(fā)揮抗哮喘。

γ-GCS的合成是受轉(zhuǎn)錄因子Nrf2調(diào)控[20]，同時Nrf2也可以調(diào)節(jié)抗氧化因子HO-1的轉(zhuǎn)錄。研究顯示，有機粉塵會導致肺部炎癥、氣道高反應性和氧化應激。此過程Nrf2依賴基因和Nrf2核易位的mRNA表達水平增加[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組肺組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達均顯著增加，經(jīng)過Tet治療后，肺組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達進一步增強，筆者推測氧化應激條件下，機體自身可能發(fā)生了適應性反應，藥物治療進一步增強了機體抗氧化能力。

綜上所述，哮喘發(fā)作存在氧化應激現(xiàn)象，Tet對哮喘大鼠肺組織具有保護作用。其治療機制可能為通過激活Nrf2/HO-1途徑下調(diào)氧化應激水平，同時減少CysLT1和CysLTR1的含量而減輕炎癥，進而抑制α-SMA、TGF-β1、MMP-9 的表達，增加 TIMP-1 的表達，緩解氣道重塑。

圖1 3組大鼠肺組織病理檢查所見（HE染色，×200）

圖2 3組大鼠肺組織α-SMA和Nrf2蛋白免疫熒光檢測所見