利多卡因?qū)χ嗵钦T導(dǎo)大鼠急性肺損傷的影響及機(jī)制

劉瑞蓮，姚雯菲，許立新

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院，廣州510180

急性肺損傷(ALI)更嚴(yán)重的形式為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。ALI/ARDS已經(jīng)成為重癥監(jiān)護(hù)室患者發(fā)病和病死最主要的原因，是膿毒癥最常見的并發(fā)癥，其機(jī)制與治療方案是當(dāng)前迫切希望解決的難題。利多卡因的抗炎作用已經(jīng)獲得廣泛的認(rèn)可，其機(jī)制可能與阻滯神經(jīng)軸突上的離子通道有關(guān)，ATP門控的嘌呤能P2X7受體(P2X7R)主要表達(dá)在免疫細(xì)胞中，并且在已知的一些炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，可以誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的成熟和釋放，并且啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)[1, 2]。研究表明,利多卡因與P2X7R均參與多種炎癥反應(yīng)過程，但關(guān)于兩者之間的關(guān)系研究甚少。那么利多卡因是否通過抑制ATP門控的離子通道來抑制P2X7R的表達(dá)，從而降低炎癥反應(yīng)還需進(jìn)一步研究。2017年3～11月，我們觀察了利多卡因?qū)LI模型大鼠肺損傷程度及P2X7R/炎癥小體NLRP3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(P2X7R/NLRP3/Caspase-1)軸表達(dá)的變化，探討利多卡因?qū)LI的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級雄性SD大鼠40只(購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心)，體質(zhì)量180～220 g，自由飲食，晝夜節(jié)律飼養(yǎng)。脂多糖(LPS)粉劑(L2880，Sigama公司，美國)；2%利多卡因、戊巴比妥鈉(Sigama公司，美國)；P2X7R兔多克隆抗體(AB5246，Millipore公司，美國)；NLRP3兔單克隆抗體(ab210491，Abcam公司，美國)；Caspase-1兔單克隆抗體(ab108362，Abcam公司，美國)；GAPDH(GB13002，武漢谷歌生物科技，中國)；HRP標(biāo)記山羊抗兔(GB23303，武漢谷歌生物科技，中國)；HRP標(biāo)記驢抗山羊(GB23404，武漢谷歌生物科技，中國)；IL-1β、HMGB1 ELISA試劑盒(SEA563Ra，SEA399Ra，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，中國)；MPO試劑盒(A044，南京建成生物工程研究所，中國)。酶標(biāo)檢測儀(Epoch，BioTeK，美國)；全自動生化分析儀(Chemray 240，深圳雷杜生命科技，中國)；掃描儀(EPSON，V300，日本)；電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽(BIO-RAD 公司，美國)；顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.2 動物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分成5組：生理鹽水對照組(NS組)、脂多糖(LPS)模型組(LPS組)、5 mg/kg利多卡因治療組(5LD組)、10 mg/kg利多卡因治療組(10LD組)、20 mg/kg利多卡因治療組(20LD組)，每組8只。

1.3 模型制備及干預(yù)方法 實驗前所有大鼠禁食12 h，自由飲水。腹腔注射5 mg/kg LPS建立ALI模型，以LPS組中LPS給藥時間為基點，三個利多卡因治療組分別于LPS注射前10 min、LPS注射后1 h、LPS注射后3 h三個時間點腹腔注射相應(yīng)劑量1%利多卡因，LPS組在這三個時間點給予等量生理鹽水，NS組四個時間點給予等量的生理鹽水。

1.4 實驗標(biāo)本的處理 建模24 h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠，固定于大鼠解剖板，開胸暴露心臟，尋找右心室，左心耳，用50 mL注射器將50 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液PBS緩慢從右心室灌注，剪開左心耳放血，至肺變白。灌注完畢，結(jié)扎左側(cè)肺支氣管，快速取下肺組織至預(yù)冷的PBS中漂洗，右肺上、中、下葉在預(yù)冷的PBS液中分別剪成200 mg左右大小，再次放入預(yù)冷的PBS中漂洗，用濾紙吸干表面水分于液氮中速凍后放至-80 ℃冰箱保存，用于Western blotting、Elisa、MPO檢測。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 肺組織病理學(xué) 采用HE染色法，左上肺組織在預(yù)冷的PBS中剪成1 cm×1 cm×1 cm大小，用濾紙吸干表面水分放入4%多聚甲醛固定48 h，制成厚5 μm的石蠟切片，行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.5.2 肺濕干重比值(W/D) 左下肺組織用濾紙吸干表面水分稱重(濕重W)，用等面積錫紙包裹后置于72 ℃烤箱48～72 h，至衡重后稱重(干重D)，計算W/D。

1.5.3 P2X7R、NLRP3、Casepase-1 蛋白表達(dá) 采用Western blotting法檢測。取右肺組織剪成200 mg左右大小，于液氮中速凍后放至-80 ℃冰箱保存，解凍后加入10倍組織體積本試劑冰上徹底勻漿，離心收集上清，采用BCA法測蛋白濃度。取60 μg總蛋白于10%分離膠和5%的濃縮膠中進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離的目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，于含5% BSA封閉液中室溫1 h。加入適量按比例稀釋的特異性一抗(P2X7R比例1∶250，NLRP3與Casepase-1比例1∶1 000)，然后添加HRP標(biāo)記的二抗(1∶3 000)。最后添加適量ECL發(fā)光試劑盒中的AB混合液，根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件。以AlphaEase FC軟件取條帶灰度值。以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值比值來計算該蛋白的表達(dá)量。

1.5.4 肺組織IL-1β、HMGB1水平 采用ELISA法檢測。檢測嚴(yán)格按照ELISA試劑盒進(jìn)行，在酶標(biāo)儀上，于450 nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出樣本濃度。

1.5.5 肺組織MPO含量 采用比色法檢測。檢測嚴(yán)格按照MPO試劑盒進(jìn)行，全自動生化分析檢測指標(biāo)結(jié)果是儀器自動生成樣本濃度，根據(jù)試劑盒公式計算MPO活力(U/克組織濕重)=(測定OD值-對照OD值)/11.3×取樣量。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)觀察 NS組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔無水腫擴(kuò)張，無炎癥滲出，肺泡腔清晰；LPS組肺組織結(jié)構(gòu)明顯受損，肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺泡腔紅細(xì)胞滲出，肺泡間隔水腫、大量炎癥細(xì)胞浸潤、出血；20LD組肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡間隔水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、出血均明顯減輕；10LD組減輕程度不如20LD組，5LD組減輕程度則不明顯。見圖1。

注：A、B、C、D、E分別代表NS組、LPS組、5LD組、10LD組、20LD組。

圖1 大鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色法，200×)

2.2 各組肺組織W/D比較 NS組、LPS組、5LD組、10LD組、20LD組W/D分別為1.680±0.126、2.181±0.046、2.062±0.110、1.920±0.030、1.792±0.116。LPS組W/D高于NS組，10LD組、20LD組W/D均低于LPS組(P均<0.01)。

2.3 各組肺組織P2X7R、NLRP3及Caspase-1蛋白表達(dá)比較 LPS組P2X7R、NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)均高于NS組(P均<0.01)；10LD組P2X7R、NLRP3蛋白表達(dá)均低于LPS組(P均<0.05)；20LD組P2X7R、NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)均低于LPS組(P均<0.05)。見表1、圖2。

組別P2X7R/GAPDHNLRP3/GAPDHCaspase-1/GAPDHNS組0.070 00±0.050 000.063 30±0.051 320.040 00±0.177 32LPS組0.930 00±0.265 80△0.556 70±0.125 80△0.856 70±0.277 90△5LD組0.730 00±0.173 500.370 00±0.134 500.660 00±0.280 0010LD組0.580 00±0.150 00?0.216 70±0.113 70#0.500 00±0.190 0020LD組0.296 70±0.032 15#0.103 30±0.058 59#0.246 70±0.204 30?

注：與NS組比較，*P<0.05,△P<0.01;與LPS組比較，#P<0.01。

圖2 各組肺組織P2X7R、NLRP3及Caspase-1蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

2.4 各組肺組織IL-1β、HMGB1水平及MPO活力比較 LPS組IL-1β、HMGB1、MPO水平均高于NS組(P<0.01)；5LD組、10LD組、20LD組IL-1β、HMGB1、MPO水平均低于LPS組(P<0.05或0.01)。見表2。

組別IL-1β(pg/mL)HMGB1(pg/mL) MPO活力(U/克組織濕重)NS組49.210±4.3972 204.00±717.10 0.014 670±0.006 658LPS組158.100±19.220△4 232.00±425.70△ 0.203 700±0.063 790△5LD組118.900±19.000?3 323.00±166.40? 0.120 700±0.006 658?10LD組91.700±17.870#3 091.00±103.60# 0.082 670±0.024 030#20LD組62.780±5.636#2 786.00±78.42# 0.059 000±0.021 790#

注：與NS組比較，*P<0.05,△P<0.01;與LPS組比較，#P<0.01。

3 討論

ALI在臨床上多發(fā)生于嚴(yán)重創(chuàng)傷、大面積燒傷、大量失血、重度感染、膿毒癥、胃內(nèi)容物吸入、外科大手術(shù)后，并可進(jìn)一步發(fā)展為ARDS，由于肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，進(jìn)而出現(xiàn)肺泡毛細(xì)血管屏障破壞、肺間質(zhì)水腫、進(jìn)行性低氧血癥、呼吸窘迫等臨床綜合征[3]。其中，中性粒細(xì)胞聚集可對肺血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，而炎癥因子可直接作用于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，或通過多種炎癥通路導(dǎo)致肺損傷，繼而引起炎癥放大級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致多臟器功能障礙甚至衰竭。在臨床中因其高發(fā)病率和死亡率，引起臨床醫(yī)生的高度重視，但至今未發(fā)現(xiàn)治療急性肺損傷的特效藥物，呼吸支持技術(shù)認(rèn)為是目前臨床中治療ALI/ARDS最重要的治療手段[4]，主要包括小潮氣量通氣、呼氣末正壓、高頻振蕩通氣、體外肺結(jié)合膜技術(shù)等。但ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病情嚴(yán)重且進(jìn)展快，盡管應(yīng)用先進(jìn)的技術(shù)進(jìn)行支持性治療，但ALI/ARDS的病死率居高不下。因此其治療方案成為當(dāng)前迫切希望解決的難題,其分子機(jī)制也成了當(dāng)前研究熱點，近年來，關(guān)于其通路的研究主要包括P38MAPK、TLR4、NF-κB、RAGE、NLRP3/IL-1β等。LPS為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，可誘導(dǎo)多種組織器官炎癥，破壞免疫系統(tǒng)，LPS刺激后，關(guān)鍵的炎性細(xì)胞因子包括TNF-α、IL - 6和IL-1β等釋放并參與急性肺損傷的進(jìn)展。本研究根據(jù)文獻(xiàn)選擇5 mg/kg LPS進(jìn)行腹腔注射建立膿毒癥急性肺損傷大鼠模型[5]，而腹腔注射給藥方法一般為建立肺外源性損傷模型，炎癥細(xì)胞多集中在肺間質(zhì)和血管，故選取肺組織標(biāo)本從整體去評估急性肺損傷程度。

利多卡因作為一種臨床上常用的酰胺類局麻藥，具有鎮(zhèn)痛、抗心律失常的作用，還具有鎮(zhèn)咳、抗炎、抗癲癇、抗癌藥增敏、免疫調(diào)節(jié)等作用，特別是利多卡因的抗炎作用已經(jīng)得到更廣泛的認(rèn)可，可抑制多種炎癥介質(zhì)的釋放。利多卡因在臨床上靜脈用藥一般為1～2 mg/kg,根據(jù)《醫(yī)用實驗動物學(xué)》里大鼠與人類用藥量的轉(zhuǎn)換系數(shù)(W)為6.25，則動物用藥量為6.25～12.5 mg/kg，又因動物對藥量耐受高于人類且本實驗給藥方法采取腹腔注射，吸收速度較慢，故選擇5、10、20 mg/kg三個劑量。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素注射前1 h開始靜脈注射利多卡因并維持2 h，可顯著降低膿毒癥模型動物的病死率[6]。由于LPS給藥后2～3 h炎癥因子釋放已經(jīng)達(dá)到較高水平，為對早期炎癥起到抑制作用，在模型建立前10 min預(yù)先給藥，并將給藥時間集中在前3 h，盡量達(dá)到穩(wěn)定有效的血藥濃度，消除治療空白。

P2X7R在炎癥反應(yīng)中扮演著危險信號“感受器”的角色：即監(jiān)視炎癥部位危險信號ATP的釋放情況，細(xì)胞損傷、機(jī)械刺激、缺血或病原體入侵誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ATP釋放到細(xì)胞外時，P2X7R被活化[7]。P2X7受體不僅可以通過較小的陽離子，如鈉離子、鉀離子和鈣離子，也可以通過較大的陽離子，使得細(xì)胞外ATP升高，參與多種炎癥反應(yīng)。還有研究發(fā)現(xiàn)，利多卡因可通過三磷酸腺苷鹽敏感鉀離子通道，減輕細(xì)胞因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮和血管平滑肌細(xì)胞的損傷[8]，或者通過抑制細(xì)胞內(nèi)鈣的增加及p38 MAPK的活化，減弱小膠質(zhì)細(xì)胞外ATP引起的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生(包括TNF-α、IL-1β、IL-6)[9]。在之前的研究基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)P2X7R與利多卡因的抗炎機(jī)制都與ATP、離子通道有關(guān)，然而有關(guān)兩者之間的研究較少。Okura等[10]在蟾蜍卵母細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)利多卡因可以通過非競爭性的方式抑制ATP在P2X7受體中誘發(fā)的電流，并不會影響ATP與P2X7R細(xì)胞外的三個結(jié)合位點，以上研究給予了我們新思路。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS組肺組織結(jié)構(gòu)明顯受損，肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張，肺泡腔有紅細(xì)胞滲出，肺泡間隔水腫、大量炎癥細(xì)胞浸潤、出血，LPS組中W/D值明顯高于NS組，表明LPS組肺水腫程度大于NS組，LPS組MPO活力明顯高于NS組，表明中性粒細(xì)胞聚集較多；LPS組P2X7R蛋白表達(dá)均高于NS組，表明LPS注射后可誘導(dǎo)大鼠ALI造成肺組織病理損傷、肺水腫、肺組織中性粒細(xì)胞浸潤，從而使ATP釋放到細(xì)胞外引起P2X7R表達(dá)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，20LD組肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡間隔水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、出血均明顯減輕，10LD組、20LD組W/D均低于LPS組，10LD組P2X7R蛋白表達(dá)低于LPS組，20LD組P2X7R、蛋白表達(dá)低于LPS組，5LD組、10LD組、20LD組MPO水平均低于LPS組，表明利多卡因可以減輕肺組織病理損傷程度，減輕肺水腫程度，減少肺組織中性粒細(xì)胞浸潤，降低肺組織P2X7R表達(dá)水平，其中10 mg/kg和20 mg/kg的利多卡因劑量對ALI大鼠肺組織的保護(hù)作用較好，其機(jī)制可能與離子通道有關(guān)，給予利多卡因后ATP誘發(fā)的電流釋放降低，從而降低P2X7R的表達(dá)。

NLRP3炎癥小體參與多種疾病的炎癥過程，NLRP3分子激活之后，與凋亡相關(guān)微粒蛋白(ASC)、Caspase-1前體共同結(jié)合成三分子復(fù)合物NLRP3炎癥小體，自我切割激活Caspase-1。NLRP3和Caspase-1前體的激活促進(jìn)IL-1β前體的成熟并在炎癥細(xì)胞中釋放[11]。還有研究表明，P2X7R的激動引起鉀離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)的劇烈變化是IL-1β成熟的一個重要因素[2]。P2X7R在介導(dǎo)炎癥過程時需要NLRP3炎癥小體、IL-1β的參與[12]，給予P2X7R抑制劑A438079和BBG可以抑制NLRP3/ASC/Caspase-1的激活，降低炎癥因子表達(dá)[13]，表明P2X7R是NLRP3炎癥小體、Caspase-1的上游信號分子。利多卡因的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用已經(jīng)有很多研究，發(fā)現(xiàn)其可以減輕炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α、IL-18、HMGB1的表達(dá)，降低肺泡動脈血氧差，降低肺組織中性粒細(xì)胞聚集減輕肺損傷[14, 15]。本研究發(fā)現(xiàn)，10LD組NLRP3蛋白表達(dá)低于LPS組，20LD組NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)均低于LPS組，5LD組、10LD組、20LD組IL-1β、HMGB1水平均低于LPS組，以上結(jié)果表明利多卡因可以通過抑制上游信號分子P2X7受體從而降低下游NLRP3、Caspase-1、IL-1β和HMGB1的表達(dá)，且20 mg/kg利多卡因治療量對降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β和HMGB1表達(dá)的作用較強(qiáng)。

綜上所述，利多卡因可以減輕ALI大鼠的肺水腫程度，減少中性粒細(xì)胞聚集，改善肺組織病理損傷變化，降低炎癥因子IL-1β、HMGB1水平及MPO活力，其機(jī)制可能與抑制P2X7R/NLRP3/Caspase-1信號通路有關(guān)。但利多卡因參與該信號通路的具體機(jī)制及是否有其他信號通路參加有待進(jìn)一步研究。利多卡因的這一作用給臨床上研發(fā)治療ALI的藥物提供了新的靶點、新的思路。