miR-92a表達(dá)與結(jié)直腸癌病理學(xué)特征及MVD形成的關(guān)系

張志勇 丁惠娟 王偉民

結(jié)直腸癌(CRC)是病死率較高的消化系統(tǒng)腫瘤，在發(fā)病早期無(wú)明顯癥狀，不易被診斷，因此加強(qiáng)早期診斷有利于增加結(jié)直腸癌患者的存活時(shí)間，及時(shí)實(shí)施治療手段[1]。microRNAs(miRNAs)是一系列非編碼微小RNA，其高表達(dá)和原癌基因作用相似，引起細(xì)胞復(fù)制與分化功能過(guò)度激活，從而誘發(fā)腫瘤的難逆性發(fā)展[2]。有研究顯示[3]，miR-92a在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，尤適用于結(jié)直腸癌患者，且對(duì)比其他的血清分子標(biāo)志物具有高靈敏度、特異性等優(yōu)勢(shì)。因此，miR-92可能屬于癌基因，在CRC的發(fā)展進(jìn)程中擁有推動(dòng)作用。同時(shí)，難控性血管再生是惡性腫瘤的重要辨別特征，血管再生常促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移[4]。李利發(fā)等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a可能介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的產(chǎn)生，加速腫瘤的惡化速度。但目前對(duì)于miR-92a表達(dá)與CRC病理學(xué)特征和MVD形成的確切及時(shí)未有統(tǒng)一結(jié)果。本研究通過(guò)對(duì)不同病理學(xué)分期CRC患者的病理學(xué)特征與MVD數(shù)量，探究miR-92a臨床應(yīng)用的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月至2017年10月我院收集的結(jié)直腸癌組織80例(癌組織)、80例癌旁組織。男性44例，女性36例，年齡35～75歲，平均(54.1±11.6)歲，TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期29例、Ⅲ期27例、Ⅳ期4例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例；分化程度：高分化20例、中分化34例、低分化26例；浸潤(rùn)深度：T1～T2 27例、T3～T4 53例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)直腸癌患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社《外科學(xué)》第八版；②經(jīng)手術(shù)后病理學(xué)檢查確診,病理學(xué)診斷均為腺癌；③術(shù)前患者無(wú)放化療史；④患者知情并簽署知情同意書(shū)，獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌；②凝血功能疾?。虎燮渌课粣盒阅[瘤病史。

1.2 qRT-PCR技術(shù)

首先根據(jù)Trizol法對(duì)患者結(jié)直腸癌組織實(shí)施總RNA的抽提，進(jìn)而對(duì)其濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。得到稀釋后的RNA樣品。依據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。每個(gè)樣本取1 μg 總RNA 進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min。內(nèi)參基因反應(yīng)條件同上。取1 μl cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，40個(gè)循環(huán)。miR-92a含量計(jì)算利用絕對(duì)定量方法，計(jì)算miR-92a的濃度，U6 snRNA內(nèi)參qRT-PCR的反應(yīng)條件如上。

1.3 免疫組化染色

對(duì)結(jié)直腸癌組織標(biāo)本進(jìn)行脫水、石蠟包埋，制成4 μm切片。用檸檬酸鹽緩沖液實(shí)施高壓熱修復(fù)，一抗為鼠抗人CD31單抗(1∶100)，用PBS作為陰性對(duì)照，用陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，按照ABC法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞CD31表達(dá)。血管新生情況以微血管密度(MVD)表示，以CD31陽(yáng)性表達(dá)的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞表示1條單獨(dú)的微血管，先在低倍鏡(×100)下選擇血管高密度區(qū)，再于高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算其微血管數(shù)目平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組標(biāo)本組織中的miR-92aRNA表達(dá)比較

癌組織中的miR-92aRNA表達(dá)強(qiáng)度顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 兩組標(biāo)本組織中的miR-92aRNA表達(dá)比較

2.2 兩組標(biāo)本組織中CD31表達(dá)比較

癌組織中的CD31檢出率顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 兩組標(biāo)本組織中的CD31表達(dá)比較

2.3 兩組標(biāo)本組織中的miR-92aRNA表達(dá)與CD31表達(dá)的相關(guān)性

癌組織中的miR-92aRNA表達(dá)與CD31檢出率呈顯著正相關(guān)關(guān)系(γ=0.593，P<0.05)。

2.4 結(jié)直腸癌組織的miR-92aRNA表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

結(jié)直腸癌癌組織中的miR-92aRNA表達(dá)強(qiáng)度在不同TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同浸潤(rùn)深度的組織中表達(dá)強(qiáng)度具有顯著的差異(P<0.05)；結(jié)直腸癌組織中的miR-92aRNA表達(dá)強(qiáng)度在不同分化程度的癌組織中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

3 討論

Michael等首先觀察到miR-143在CRC患者的腫瘤組織中的表達(dá)明顯降低，提出microRNA可能在CRC患者早期疾病診斷上具有一定作用[6]。從這以后，利用 microRNA來(lái)診治CRC的案例逐漸變得普遍，其關(guān)于作用途徑的研究也有所突破。依據(jù)對(duì)CRC的作用效果不同通常分為致癌microRNA和抑癌microRNA，現(xiàn)臨床資料顯示[7]在CRC中前者的表達(dá)更為普遍。miR-92a屬于miR-17-92基因簇家族，其已被證實(shí)[8]為致癌microRNA，主要機(jī)制是通過(guò)阻止癌基因PTEN介導(dǎo)的PI3K/AKT通路，進(jìn)而誘導(dǎo)CRC細(xì)胞增殖、分化，使腫瘤生長(zhǎng)的速度增加，進(jìn)一步惡化病情。也有研究顯示[9]，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用是通過(guò)下調(diào)凋亡蛋白(Bim)的表達(dá)水平。王秀等[10]研究表明，miR-92a在腺瘤和CRC患者中表達(dá)水平與miR-17-92簇其他基因比較明顯上升，同時(shí)，CRC細(xì)胞中加入miR-92a拮抗劑將抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，說(shuō)明miR-92a能夠用作診治CRCd的重要方式。同時(shí)CRC疾病的過(guò)程中也伴有血管新生的情況，血管新生也是腫瘤組織生長(zhǎng)的特征現(xiàn)象[11]。腫瘤細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞若受到一系列的化學(xué)刺激，將促進(jìn)腫瘤微血管密度增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。李鵬等[12]研究表明，miRNA能特異性與血管生成因子和蛋白激酶發(fā)生反應(yīng)，調(diào)控血管生成所需的因子，進(jìn)而控制腫瘤的血管新生。通過(guò)血清microRNA診斷CRC，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[13]，但現(xiàn)如今利用血清miR-92a探究其與疾病惡化程度和MVD形成的研究并不多見(jiàn)，因此，本研究對(duì)以上兩種指標(biāo)與miR-92a基因表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行探討，具有一定科學(xué)性依據(jù)。

表3 結(jié)直腸癌組織的miR-92aRNA表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

本研究中qRT-PCR結(jié)果顯示，癌組織中miR-92aRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，得出miR-92aRNA可能具有致癌作用，其高表達(dá)能夠作為診斷TNM分期的各期CRC的手段?？赡芘cmiR-92aRNA阻止癌基因PTEN介導(dǎo)的PI3K/AKT通路，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞持續(xù)惡化有關(guān)[14]。因CD31陽(yáng)性表達(dá)的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞，可看作為一條MVD。本研究通過(guò)免疫組化得出，癌組織的CD31檢出率較癌旁組織明顯增加，即說(shuō)明前者M(jìn)VD的形成更多，相應(yīng)的提示前者細(xì)胞癌變情況嚴(yán)重。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中的miR-92aRNA表達(dá)強(qiáng)度與CD31檢出率表現(xiàn)為正相關(guān)性。說(shuō)明miR-92aRNA的高表達(dá)能夠促進(jìn)MVD的形成，相反其低表達(dá)則表示MVD的形成受到抑制。 可能原因是Ⅲ期～Ⅳ期結(jié)直腸癌細(xì)胞可合成釋放出內(nèi)含miR-92a的微泡(MVs)，其被傳送至血管內(nèi)皮細(xì)胞，使下游靶基因Dkk-3表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)制、遷移，讓內(nèi)環(huán)境可為腫瘤血管生成提高能量，推動(dòng)腫瘤進(jìn)程[15]。本研究通過(guò)分析miR-92aRNA表達(dá)與臨床病理學(xué)特征得出，miR-92aRNA表達(dá)在不同TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同浸潤(rùn)深度的組織中各不相同，而在不同分化水平細(xì)胞中無(wú)明顯區(qū)別，提示miR-92aRNA的表達(dá)程度對(duì)Ⅲ～Ⅳ期CRC的惡化程度檢測(cè)敏感，而對(duì)于Ⅰ～Ⅱ期CRC敏感度相對(duì)較低，另外對(duì)于分化水平分類的CRC診斷效果差，這與王亞南等[16]研究結(jié)果類似。

根據(jù)以上分析可看出，Ⅲ～Ⅳ期CRC組織中的miR-92aRNA表達(dá)明顯上調(diào)，并且與腫瘤惡化和MVD形成有關(guān)。因此，miR-92aRNA可作為臨床早期診斷Ⅲ～Ⅳ期CRC的方式，也能夠作為治療的藥物作用靶點(diǎn)。但本研究尚未考慮microRNA能夠調(diào)控多種基因表達(dá)，對(duì)其靶向治療存在一定阻礙，另外有研究顯示[17]，表達(dá)miR-320a也可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲，可作為新的治療方向。本研究樣本量少，后續(xù)仍需進(jìn)行大量臨床數(shù)據(jù)收集，為深入探究miR-92aRNA在臨床應(yīng)用的實(shí)際意義。