食管鱗癌中STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)情況

童 薇 張 敬 朱艷麗 雍 翔

食管癌屬于1種消化道惡性腫瘤，在臨床極為常見(jiàn)。在我國(guó)，食管癌具有較高的發(fā)病率及死亡率[1]。近年來(lái)，相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[2]，在惡性腫瘤中，食管癌發(fā)病率位居第五位，死亡率位居第四位，僅次于肺癌、肝癌、胃癌。要想有效治療食管癌，對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行改善，就應(yīng)該將能夠?qū)⑹彻馨┌l(fā)生發(fā)展及預(yù)后特征性反映出來(lái)的分子生物學(xué)指標(biāo)尋找出來(lái)。本研究探討了食管鱗癌中STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2016年4月至2019年4月我院食管鱗癌患者80例，其中男性50例，女性30例，年齡46～80歲，平均(63±5.0)歲。另選取癌旁1～3 cm處組織40例，對(duì)應(yīng)癌瘤灶旁5 cm以外處上下殘端正常食管粘膜組織40例。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

購(gòu)買(mǎi)Proteintech公司生產(chǎn)的STC2抗體稀釋1∶50，北京中杉金橋公司生產(chǎn)的MMP-9、PCNA一抗稀釋1∶100，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒、PV-6001、6002免疫組化試劑盒，PBS磷酸鹽緩沖液，日本奧林巴斯BX41顯微鏡，德國(guó)2035石蠟切片機(jī)。

1.3 方法

應(yīng)用免疫組織化學(xué)二步法，用切片機(jī)連續(xù)切片組織蠟塊，切片厚度為4 μm左右。然后漂片，之后攤片，最后烤片。在二甲苯Ⅰ中放置切片10 min，在二甲苯Ⅱ中放置切片10 min，在無(wú)水酒精Ⅰ中放置切片3 min，在無(wú)水酒精Ⅱ中放置切片3 min，在90%酒精中放置切片3 min，在80%酒精中放置切片3 min，在70%酒精中放置切片3 min，脫蠟至水。在3%過(guò)氧化氫去離子水中進(jìn)行15 min的孵育，將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷，PBS沖洗。在高壓鍋中放置，對(duì)抗原進(jìn)行高壓修復(fù)，壓力閥噴氣后計(jì)時(shí)2 min，然后自然冷卻到室溫，PBS浸洗。將兔抗人STC2抗體、MMP-9抗體、鼠抗人PCNA抗體滴加到三組切片中，在室溫下進(jìn)行1～1.5 h的孵育，然后在4 ℃的溫度下過(guò)夜。第2 d用PBS進(jìn)行5 min浸洗，共3次。將PV-6001滴加到STC2、MMP-9中，將PV-6002滴加到PCNA中，在37 ℃的溫度下進(jìn)行1 h的孵育，PBS進(jìn)行5 min浸洗，共3次。將DNA滴加其中進(jìn)行2～3 min顯色，沖洗過(guò)程中將蒸餾水充分利用起來(lái)，將染色終止。蘇木精復(fù)染3 min，過(guò)水。鹽酸酒精一過(guò)、氨水3 min，過(guò)水。80%酒精5 min，90%酒精5 min，無(wú)水酒精Ⅰ5min，無(wú)水酒精Ⅱ5 min，透明，封片過(guò)程中將中性樹(shù)膠充分利用起來(lái)。將說(shuō)明書(shū)推薦組織切片設(shè)定為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 觀察指標(biāo)

顯微鏡下對(duì)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率進(jìn)行評(píng)定，將5個(gè)區(qū)域隨機(jī)選取出來(lái)，×400倍光鏡下對(duì)腫瘤組織中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，最終將平均值計(jì)算出來(lái)。STC2陽(yáng)性染色顆粒在細(xì)胞質(zhì)中分布，呈棕黃色，陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞率0～10%、11%～50%、51%～75%、76%～100%分別評(píng)定為0、1、2、3。腫瘤細(xì)胞無(wú)著色、淡黃色、黃色、棕黃色分別評(píng)定為0、1、2、3。染色陽(yáng)性細(xì)胞率×染色強(qiáng)度=染色指數(shù)，<4、≥4分別評(píng)定為陰性、陽(yáng)性[3]。MMP-9陽(yáng)性信號(hào)為抗體有棕黃色顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，將5個(gè)高倍視野(×400)從每張切片中隨機(jī)選取出來(lái)觀察，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%、≥10%分別評(píng)定為陰性表達(dá)、陽(yáng)性表達(dá)[4]。PCNA陽(yáng)性染色顆粒在細(xì)胞核中分布，呈棕黃色，將各例標(biāo)本陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)算出來(lái)，分為四級(jí)，0～25%、25%～50%、51%～75%、76%～100%分別評(píng)定為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)。無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)、Ⅰ～Ⅳ級(jí)分別評(píng)定為陰性、陽(yáng)性[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料用率表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。用COX回歸分析進(jìn)行多因素分析，應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)情況比較

食管鱗癌組織中STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于食管癌旁、正常食管粘膜組織(P<0.05)，食管癌旁組織中STC2、MMP-9表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于正常食管粘膜組織(P<0.05)，但食管癌旁、正常食管粘膜組織中PCNA表達(dá)陽(yáng)性率的差異不顯著(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同組織中STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)情況比較(例，%)

2.2 食管鱗癌患者STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

食管鱗癌患者病理分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級(jí)低分化、有淋巴管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于病理分期Ⅰ～Ⅱ期、病組織學(xué)分級(jí)中高分化、無(wú)淋巴管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，但不同性別、年齡、病變長(zhǎng)度、病變直徑、腫瘤部位患者的STC2表達(dá)陽(yáng)性率之間的差異均不顯著(P>0.05)。具體見(jiàn)表2。

3 討論

斯鈣素2(STC 2)屬于1種糖蛋白激素，在腎臟、腸的鈣磷運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)鈣磷平衡中參與。近年來(lái)，相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[6]，乳腺癌、胃癌、喉癌等多種腫瘤組織中具有較高的STC 2表達(dá)，同時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)、侵襲等均和STC 2關(guān)系密切。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[7-9]，STC 2在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中和腫瘤組織適應(yīng)低氧環(huán)境相關(guān)，同時(shí)在腫瘤細(xì)胞增殖中參與，通過(guò)血管生成素(Ang-2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)為腫瘤組織血管生成提供良好的前提條件，促進(jìn)腫瘤侵襲性的增加，為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供良好的前提條件。相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者研究了食管癌中的STC 2[10-11]，結(jié)果表明，腫瘤增殖、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均和STC 2關(guān)系密切，同時(shí)，食管癌預(yù)后也和STC 2關(guān)系密切?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)屬于1種Ⅳ型膠原酶，能夠?qū)?xì)胞外基質(zhì)的合成、降解代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞間、細(xì)胞和基質(zhì)間的信號(hào)傳遞造成影響，從而對(duì)細(xì)胞分化、遷移、組織重塑等進(jìn)行調(diào)節(jié)，為腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移提供良好的前提條件。MMP-9能夠表達(dá)于腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞中。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶的輔助蛋白，在細(xì)胞核中有兩種PCNA存在，1種具有可溶性，另1種具有不溶性，其中可溶性PCNA表達(dá)于細(xì)胞周期各期中，在DNA合成過(guò)程中，其表達(dá)量變化不顯著；不溶性PCNA具有較高的穩(wěn)定性，不顯著表達(dá)于G0～G1期細(xì)胞中，大幅度表達(dá)于G1晚期細(xì)胞中，達(dá)到高峰在S期細(xì)胞中，顯著降低在G2-M期細(xì)胞中，DNA合成和其表達(dá)量一致，對(duì)其在細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)能夠?qū)⒂行б罁?jù)提供給臨床對(duì)細(xì)胞增殖狀態(tài)的評(píng)定工作。

表2 食管鱗癌患者STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析(例，%)

腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和STC2、MMP-9關(guān)系密切，腫瘤細(xì)胞增殖和PCNA關(guān)系密切。但是現(xiàn)階段，還較少有相關(guān)醫(yī)學(xué)研究報(bào)道上述3個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)在食管癌組織中的意義。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[12-15]，和癌旁組織、正常食管粘膜組織相比，食管癌組織中具有顯著較高的STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)，病理分期、低分化、淋巴管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均和其關(guān)系密切。在食管癌患者預(yù)后的影響因素中，STC2是獨(dú)立因素，如果患者具有較高的STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)，那么其就會(huì)具有較差的生存預(yù)后，而如果患者同時(shí)具有較高的STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)，那么其就會(huì)具有更差的生存預(yù)后。本研究結(jié)果表明，食管鱗癌組織中STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于食管癌旁、正常食管粘膜組織，食管癌旁組織中STC2、MMP-9表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于正常食管粘膜組織，但食管癌旁、正常食管粘膜組織中PCNA表達(dá)陽(yáng)性率之間的差異不顯著。食管鱗癌患者病理分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級(jí)低分化、有淋巴管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于病理分期Ⅰ～Ⅱ期、病組織學(xué)分級(jí)中高分化、無(wú)淋巴管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，但不同性別、年齡、病變長(zhǎng)度、病變直徑、腫瘤部位患者的STC2表達(dá)陽(yáng)性率之間的差異均不顯著，和上述相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致。

總之，食管鱗癌中STC2、MMP-9及PCNA表達(dá)陽(yáng)性率均顯著提升，與病理分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，值得重視。