宮頸鱗癌患者組織中HIF-1α和VEGF的表達及在放療中的意義

潘秀花 白 力 謝福川 江曉聰 藍玉宏 肖 偉

宮頸癌屬于1種女性惡性腫瘤，在臨床極為常見，在發(fā)展中國家中，其發(fā)病率位居第一位[1]。長期以來，其5年生存率維持在約55%。目前，臨床普遍認為[2]，放療在宮頸癌的治療中發(fā)揮著極為重要的作用，尤其是在中晚期宮頸癌的治療中。雖然近年來，醫(yī)學界在一定程度上改善了放療技術(shù)設(shè)備，比如，應(yīng)用了計算機、后裝治療技術(shù)、高能射線等，但是并沒有在極大程度上改進宮頸癌的療效，同時也沒有在極大程度上提升患者的生存率，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因主要為沒有控制局部腫瘤、遠處轉(zhuǎn)移。相關(guān)醫(yī)學研究表明[3]，腫瘤細胞乏氧是沒有控制局部腫瘤、遠處轉(zhuǎn)移的主要誘發(fā)因素，腫瘤細胞對放射線敏感性在其持續(xù)性增長浸潤等因素下降低，放療副反應(yīng)對有效治療劑量的增加造成了限制，對放療治療療效造成了不良影響。實驗證實[4-5]，和乏氧條件相比，有氧條件下細胞具有顯著較高的敏感性，腫瘤細胞對放射治療敏感性降低的主要原因為存在乏氧細胞。HIF-1a和VEGF均與腫瘤血管的發(fā)生密切相關(guān)，阻斷HIF-1a從而使誘導VEGF的轉(zhuǎn)錄及表達減少，可抑制腫瘤血管的生成及腫瘤生長。本研究探討了宮頸鱗癌患者組織中HIF-1α和VEGF的表達及在放療中的意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2016年8月至2018年8月我院宮頸鱗癌單純放療患者60例，隨機分為2組：一組緩解組(30例)，一組未緩解組(30例)。緩解組患者年齡45～60歲，平均(47.4±7.6)歲。在腫瘤大小方面，20例≤4 cm，10例>4 cm；在臨床分期方面，17例為ⅡB期，13例為ⅢA～B期；在病理分級方面，8例為高分化，12例為中分化，10例為低分化。未緩解組患者年齡46～60歲，平均(48.2±7.5)歲。在腫瘤大小方面，19例≤4 cm，11例>4 cm；在臨床分期方面，16例為ⅡB期，14例為ⅢA～B期；在病理分級方面，9例為高分化，10例為中分化，11例為低分化。兩組患者的一般資料比較差異均不顯著(P>0.05)。

1.2 納入和排除標準

納入標準：①臨床資料均詳細；②均經(jīng)病理診斷為宮頸鱗癌；③均接受放療治療。排除標準：①活檢前接受過放化療治療；②缺乏完整的臨床資料；③合并其他嚴重疾病。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 采用高能X線治療機對兩組患者進行體外放療，放療技術(shù)采用三維適形放療或三維適形調(diào)強放療，劑量為95%PGTVn： 6 000 cGy/25次，95%PTV：4 500～5 000 cGy/25次，內(nèi)照射采用高劑量率192銥后裝治療5～6次，A點劑量在3 000～3 600 cGy之間。

1.3.2 檢測方法 購買北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的兔抗人HIF-1α多克隆抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的兔抗人VEGF單克隆抗體，日本Olympus公司生產(chǎn)的Olympus顯微鏡。數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)為motic Med 6.0。運用免疫組化EM-vision二步法檢測兩組患者組織中HIF-1α和VEGF的表達，用10%福爾馬林固定標本，常規(guī)脫水石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為3～4 μm。逐步脫蠟至水，用PBS進行10 min洗滌，共3次。用0.01的枸櫞酸修復液進行15 min微波修復，涼至室溫。室溫下在3%過氧化氫中進行10 min作用。用PBS進行10 min的洗滌，共3次。再次用PBS進行10 min的洗滌，共3次。將兔抗人HIF-1α抗體和兔抗人VEGF抗體加入，工作濃度分別為1∶300、1∶100。在4 ℃的溫度下過夜。用PBS進行10 min的洗滌，共3次。將通用型二抗添加其中，在37 ℃的溫度的溫箱中放置25 min。用PBS進行10 min的洗滌，共3次。顯色，在此過程中將新鮮配置的DAB顯色液充分利用起來，用流水進行10 min的沖洗，用蘇木精進行5～10 min的復染，用流水進行1 min的返藍，依次脫水、透明、封固，之后封片，在此過程中將中性樹膠充分利用起來。顯微鏡下對結(jié)果進行判斷并采圖。

1.4 結(jié)果判定

HIF-1α陽性細胞呈棕黃色，則胞核或胞質(zhì)上定位，高倍鏡下(×400)將5個視野從每張切片中隨機選取出來，對200個細胞/視野進行計數(shù)，共計1000個，陽性細胞數(shù)<1%、1%～10%、11%～50%、>51%分別評定為-、+、++、+++[6]；VEGF陽性細胞呈棕黃色，在胞質(zhì)上定位，依據(jù)切片中著色細胞數(shù)量比率分類，<5%、6%～25%、26%～50%、>51%分別評定為-、+、++、+++[7]。

1.5 統(tǒng)計學分析

計數(shù)資料用率表示，用χ2檢驗。用Pearson相關(guān)性分析分析相關(guān)性，應(yīng)用SPSS 21.0，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較

兩組患者的一般資料比較差異均不顯著(P>0.05)(表1)。

2.2 兩組患者HIF-1α表達比較

60例患者中，HIF-1α表達陽性47例，陽性率為78.3%，其中未緩解組患者的HIF-1α表達陽性率[90.0%(27/30)]，顯著高于緩解組[66.7%(20/30)](P<0.05)。具體見表2。

2.3 兩組患者VEGF表達比較

60例患者中，VEGF表達陽性39例，陽性率為65.0%，其中未緩解組患者的VEGF表達陽性率[80.0%(24/30)]顯著高于緩解組[50.0%(15/30)](P<0.05)。具體見表3。

表1 兩組患者的一般資料比較(例，%)

表2 兩組患者HIF-1α表達情況比較(例，%)

表3 兩組患者VEGF表達比較(例，%)

2.4 兩組患者HIF-1α和VEGF表達的相關(guān)性分析

未緩解組患者HIF-1α與VEGF表達呈顯著正相關(guān)關(guān)系(γ=0.958，P<0.05)，但緩解組患者的HIF-1α與VEGF表達無相關(guān)性(γ=0.670，P>0.05)。

3 討論

近年來，臨床不斷深入地研究了腫瘤，相關(guān)醫(yī)學研究表明[8-10]，在生長過程中，腫瘤特別是實體惡性腫瘤極易有缺氧現(xiàn)象發(fā)生。缺氧細胞會放射治療、化學治療，因此亟待臨床將1個可靠的代表缺氧的標志尋找出來來對治療的合理性進行評價?，F(xiàn)階段，相關(guān)醫(yī)學研究表明[11-12]，腫瘤細胞局部缺氧主要對缺氧誘導因子-1(HIF-1)的產(chǎn)生進行誘導，其屬于1種轉(zhuǎn)錄因子，在特異性低氧狀態(tài)下將活性發(fā)揮出來，其組成成分為α亞基、β亞基，HIF-1α是HIF-1α特有的，HIF-1β是HIF-1的組成性表達。HIF-1α屬于1種氧調(diào)節(jié)蛋白，對HIF-1活性具有決定性作用。細胞中的HIF-1α在缺氧等應(yīng)激條件下被激活，使機體、組織、細胞將一系列適應(yīng)性反應(yīng)產(chǎn)生，從而對供氧平衡進行維持，在多種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化中參與，為腫瘤生長提供良好的前提條件。

豐富的營養(yǎng)供給在惡性腫瘤的持續(xù)性生長、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，在惡性腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中，對新生血管生成進行誘導是1個前提條件，如果未生成血管，那么原發(fā)腫瘤的生長厚度到約107個細胞就不再增大，或生長不會超過1～2 mm3。腫瘤組織中血管生成將重要的基礎(chǔ)條件提供給了氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)向腫瘤組織進入、將代謝產(chǎn)物向組織細胞外運出、腫瘤細胞向靶器官遷移。血管生成確定則腫瘤生長、轉(zhuǎn)移，腫瘤細胞能夠?qū)⒈姸嗟难苌梢蜃臃置诔鰜怼Ｆ渲?，現(xiàn)階段，VEGF作為1種血管生成促進因子最為關(guān)鍵，在腫瘤血管生成的參與調(diào)控因子中，其占有重要地位，能夠和血管內(nèi)皮細胞特異性結(jié)合，為內(nèi)皮細胞生長提供良好的前提條件，促進血管通透性的增加，進而為血管生成提供良好的前提條件[13-14]。

腫瘤組織局部缺氧會將VEGF基因的表達水平上調(diào)，該作用和HIF-1α關(guān)系密切，在基因水平上，活化的HIF-1α對VEGF表達進行直接調(diào)控，能夠增強VEGF的穩(wěn)定性，同時促進VEGF轉(zhuǎn)錄活性的增加，為腫瘤血管形成提供良好的前提條件，使其對缺氧環(huán)境進行適應(yīng)，同時抵抗放化療。此外，腫瘤血管形成將良好的條件創(chuàng)造給了腫瘤的不斷增大、遠處轉(zhuǎn)移、局部浸潤。相關(guān)醫(yī)學研究表明[15]，在宮頸癌放射治療過程中，HIF-1α和VEGF可能發(fā)揮著主要作用，在預(yù)測宮頸癌放射治療療效及患者預(yù)后的過程中，可以將其作為1個參考指標。同時，在宮頸癌治療中，HIF-1α和VEGF也可能能夠作為新參考指標。本研究結(jié)果表明，60例患者中，HIF-1α表達陽性47例，陽性率為78.3%，其中未緩解組患者的HIF-1α表達陽性率90.0%(27/30)顯著高于緩解組66.7%(20/30)(P<0.05)。60例患者中，VEGF表達陽性39例，陽性率為65.0%，其中未緩解組患者的VEGF表達陽性率80.0%(24/30)顯著高于緩解組50.0%(15/30)(P<0.05)。未緩解組患者的HIF-1α和VEGF的表達呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，但緩解組患者的患者的HIF-1α和VEGF的表達無相關(guān)性(P>0.05)，和上述相關(guān)醫(yī)學研究結(jié)果一致。

總之，宮頸鱗癌放療緩解患者組織中HIF-1α和VEGF的表達陽性率顯著低于放療未緩解患者。